Année Universitaire 2014 – 2015 Unité d’Enseignement 2 Concours Blanc Correction détaillée Cette épreuve a eté intégralement relue et corrigée par les enseignants. 10 pages 10 questions 60 minutes Yasmine NASREDDIN William OZIAT 06/12/2014 Question 1 : AE org Sni* to View A. VRAI ! En effet sur la figure 1-a on voit bien au niveau des clones Cl, CIO, C8 et C12 une surexpression de CDC37. B. FAUX ! La surexpression de la CDC37 entraine une augmentation de l’expression de la CDK4.
On peut voir cela sur la figure 1-b : au niveau des colonnes Cl ‘CIO et C8/C12 où il y a une surexpression de cdc37) on observe bien une augmentation de l’expression de CDK4. La surexpression de CDC37 entraine bien une élévation niveau du gène. D. FAUX ! Cabsence d’expression de la protéine CDC37 n’entraine pas une absence d’expression de la protéine CDK4 dans les cellules 03 mais une diminution de sont expression. Cffigure 1-d. E. FAUX ! On ne peut pas conclure cela à partir d’une seule exper. nce. Question 3 : Rien ! A. FAUX ! L’activité de CRAF est mesurée grâce à la phosphorylation de MECK1/2 et ERKI /2. Au niveau de la figure 2-a, on
FAUX ! E. FAUX ! Question 4 : ABCE A. VRAI ! Tout à fait, c’est du cours . B. VRAI ! Sur les figures 3-a et 3-5 on observe une demi-vie plus importante de la Cdk4 dans les cellules surexprimant Cdc37_ La demi-vie étant plus longue, on peut en *AGF 9 rif q iltration est une technique chromatographique utilisant des billes poreuses, il n’est en aucun cas question de centrifugation. B. FAUX ! Elle permet aussi de renseigner la nature des partenaires protéiques indirects de la protéine étudiée. C. VRAI !
Dans les cellules contrôles la protéine Cdk4 apparait sous 3 formes principales : environ 44kd, environ 440 kd et de larges complexes >640 kd alors que dans les cellules surexprimant Cdc37, les Cdk4, sont présent majoritairement dans leur formes du plus haut poids moléculaire. D. VRAI ! Sur la figure 4-a au niveau de l’immunorécpitation de Cdk4, on voit que lorsqu’il y a surexpression de CDC37 on précipite également HSP90. cela signifie donc qu’il y a bien une liaison (directe ou indirecte) entre Cdk4 et HSP90. E. VRAI !
L’immunoprécip•tation est une technique qui consiste en la reconnaissance d’une protéine cible par un anticorps couplé à une bille. Pour que l’anticorps puisse reconnaître une protéine présente dans la cellule, celle-ci doit donc être lysée. Une fois la reconnaissance faite, on effectue une centrifugation pour pouvoir précipiter dans le culot notre protéine cible ainsi que ces partenaires. Question 6 : ABE La légende nous disait que « Le si ARN 04 est dirigé vers le CDC37 endoeène et 03 est dirigé : VRAI !
On compare ici à l’intérieur du premier western blot (tout en haut dans la figure a et b) la différence d’expression entre les deux protéines CDC37. Ces protéines sont reconnues sur le même site, présent sur les deux protéines, avec les mêmes molécules, au sein de la même expérience de western blot. L’intensité de la bande sera donc proportionnelle à l’expression de la protéine. La protéine OC- CDC37 a plus migrée que l’autre CDC37, logique vu qu’elle est bien plus légère (car roncature). B : VRAI ! La question ne précise pas quelles cellules on regarde (HCTI 16 ou HT29). n considère donc cette affirmation devant être vérifiée pour les deux cellules HCTI 16 et HT29. Il faut ici comparer les colonnes 3 et 4 aux colonnes 1 et 2 pour les cellules HCTI 16. Et les colonnes 7 et 8 aux colonnes 5 et 6 pour les cellules HT29. Ces comparaisons sont faites dans la figure a pour les westerns blot numéro 3(BRAF) 4 (CRAF) et 5 (AKT). On ne note pas de différence majeure. L’item est donc vrai. C : FAUX ! Comme pour la question précédente, on ne précise pas uelles cellules on regarde (HCTI 16 ou HT 29). On considère donc cette affirmation devant être vérifiée pour les deux cellules HCTI 16 et HT29.
Il faut ici comparer les colonnes 3 et 4 aux colonnes 1 et 2 pour les cellules HCTI 16. Et les colonnes 7 et 8 aux colonnes 5 et 6 pour les cellules HT 29. On nous parle ici de l’activité, il s’agit donc de la figure b. L’activité de CDK4 se visualise grâce ? l’expression de protéine Rb phosphorylée, on ne n figure b. L’activité de CDK4 se visualise grâce ? l’expression de protéine Rb phosphorylée, on ne note pas de ifférence majeure entre les différentes colonnes, conclusion semblable pour l’activité de CRAF puisqu’on ne note pas de différence sur les westerns blots numéro 4 et 5.
D : FAUX ! L’expression endogène des CDC37, bien plus forte comme on l’a vu en question A que l’expression de AC-CDC37, introduit un biais majeur dans la visualisation de l’action des CDC37 tronqué. Avec les figures a et b on ne pourra donc pas voir « nettement » son action. C’est pourquoi le document 5-c, est là pour présenter l’expression de différentes protéines avec une protéine endogène inhibée. E : VRAI ! L’expression des clients de CDC37 est effectivement partiellement épulsée dans les colonnes utilisant un si ARN 03 et 04.
La présence de la simple protéine tronquée n’est donc pas substituable à la protéine CDC37 complète. Elle ne parvient pas à stabiliser l’expression de ses clients. Question 7 : BDE A : FAUX ! Au contraire l’observation des clones HCTI 16 et HT 29 indlque que les AC-CDC37 sont globalement présents sous une forme de complexes avec un poids moléculaire inférieur aux CDC37 endogènes. En effet sur les deux groupes de westerns de bas (parmi les eroupes) on visualise qu ndoeènes font de la fraction 14-16.
Comme on l’a vu plus haut et comme le rappelle la légende la fraction 2 comporte des protéines avec un poids moléculaire plus faible que la fraction 1, plus la fraction possède un numéro élevé plus elle contiendra des protéines de faibles poids moléculaires. B : VRA ! On s’intéresse ici aux deux groupes de westerns du bas (concernant Tl 1 et T 12), on observe que HSP90 et AC-CDC37 ne sont plus contenus dans la même fraction. Or s’ils ne sont plus dans la même fraction alors que précédemment les
CDC37 non tronqués (CDC37 endogènes) en faisaient partis ; une des hypothèses est bien que la liaison entre les HSP90 et les AC-CDC37 a pu être altérée. C : FAUX on observe que AC. CDC37 et CDK4 sont présentes dans les mêmes fractions, ainsi une interaction entre les deux est envisageable même avec une AC-CDC37 sans domaine C terminal. Le document ne suggère pas que le domaine C terminal de CDC37 est nécessaire ? sa liaison avec les CDK4, mais avec HSP90. Ce qui explique pourquoi on ne retrouve plus ACCDC37 dans des groupes de forts poids moléculaire. D : VRAI !
En effet, ce phénomène est visualisable aussi bien pour les cellules ACTI 16 que pour les cellules HT29. Il est d’autant plus marqué pour les cellules HT29, on voit que sans expression de AC-CDC37, (groupe de western en haut à droite), les protéines HSP90 sont majoritairement retrouvées dans les fractions 8 à 12, alors que les CDK4 sont majo itairement retrouvés dans les fractions 16 à 18. Il existe déj? potentiellement majoritairement retrouvés dans les fractions 16 à 18. Il existe déj? potentiellement des complexes HSP90-CDK4 pulsqu’on les retrouve dans les mêmes ractions.
Mais dès lors que AC-CDC37 est exprimé, on observe une répartition des deux protéines totalement différente : HSP90 se retrouve majoritairement dans les extraits 6 à IO et CDK4 dans les extraits 8 à 12. L’expression de AC-CDC37 semble donc bien favoriser les complexes HSP90CDK4. E : VRAI ! Questions de cours sur un point caractérisé par le professeur comme important. II insiste sur le fait que les pares nucléaires ne peuvent être traversés que par des complexes protéiques dont le poids moléculaire est inférieur à 30kd. Question 8 :
A : FAUX I C’est le mutant M164A, il suffit de lire correctement la figure f. Il faut faire attention, car en ordonnée c’est le % de liaison à HSP90 qui est évalué, du coup la colonne avec le % le plus bas correspond à celle que l’on recherche. Cest le mutant Ml 64A. B : VRAI ! Cet item reprend la figure précédente en questionnant un des ponts importants. De plus l’information est donnée dans le texte plus haut. C : FAUX I Le niveau d’expression est évaluable grâce au western blot présent dans la figure 7-d. On nous parle ici de la protéine Wild type exprimée dans les clones, cela correspond
