Série ABB 3 Compte rendu de Biochimie Purification et étude cinétique de la LDH or 12 Sni* to View Année universitaire 2013/2014 2 Sommaire Introduction p. l I / Principe de la séparationp. l 1) Méthodes p. l a – Préparation de l’extrait brut DIJT 1 Semestre purifier la CDH et de la caractériser du point de vue biochimique (isoformes, activité spécifique, constantes cinétiques… ). pour cela nous verrons dans un premier temps le principe de la séparation par les différentes chromatographies puis nous détaillerons dans une deuxième partie la méthode d’étude des fractions purifiées.
Enfin, après avoir expliqué le principe de l’électrophorèse, nous étudierons l’aspect cinétique de la LDH. I / Principe de la séparation 1) Méthode a) Préparation de l’extrait brut Tampon d’extraction Réactifs Concentration mère (M) Concentration fille (M) Facteur de dilution Volume mère (mL) Tris-HCI 0. 05 10 EDTA 0. 01 0001 IO Glycérol 20 P-mercaptoéthanol 0071 s O. OOI 12 chromatographie d’exclusion en faisant attention de ne pas perturber la surface de la colonne.
Chromatographie d’affinité : Dépôt Lavage Elution Après utilisation la colonne est régénérée et rééquilibrée avec ifférents tampons (tampons C, D et tampon de lavage) Chromatographie d’exclusion : Élution Après utilisation la colonne est lavée
On aurait pu suivre leur sortie grâce au chlorure de cobalt (qui est rose) et ainsi valider que le pic 3 ne contient plus de sels. Les différents pics et aliquots sont conservés au réfrigérateur. Il / Etude des fractlons purifiées Dans un premiers temps, nous avons mesuré l’activité catalytique des différents aliquots prélevés afin de suivre la purification de a CDH (EB, pic 1, pic 2, pic 3) race à une méthode cinétique (le ).
Le spectrophotomètre pyruvate est en concentra 9 l’échantillon), nous avons dilué davantage nos échantillons dans du tampon phosphate • Dans un deuxième temps, afin de déterminer la concentration en protéines de nos différents extraits (les concentrations du tableau ci-dessous seront expliqués en partie résu tats), nous avons réalisé une gamme étalon (solution mère de BSA à 200 mg/L), 2 solutions contrôles (120 mg/L) et nos différents essais selon la méthode de Bradford.
C’est un dosage colorimétrique par fixation u Bleu de Coomassie sur certains acides aminés basiques tels que l’Arginine, Histidine, Lysine (d’où l’ajout de soude). Après ajout du dernier réactif, on a vortexé et laissé agir pendant 10 minutes afin de colorer les protéines. Ainsi on peut directement suivre l’absorbance à 590 nm (longueur d’onde d’absorption du Bleu de Coomassie). a) Détermination des conc PAGF s 9 protéines dosage protéique, le CV étant inférieur à 6%.
Analyse des essais Extrait Brut AC = 33. 4375 * 0. 06 = 2 mgtmL C 33 ±2 mg/mL AC = 33. 96875 * 0,06 = 2 Concordance 31 Moyenne C = 33 AC 2 mg/mL c = 33 Pic 1 3 35 AC = 7. 875 * 0. 06 = O. S mg/mL AC 7. 71875 * 0. 06 0. 5 mg/m c = 7. 7 ± 0. 5 mg/mc 7. 2 7. 4 7. 7 7. 9 8. 2 8. 4 PAGF 19 purification, on constate dans un premier temps une diminution de l’activité catalytique (liée directement à la quantité d’enzyme). Par ailleurs l’activité totale et le rendement diminue aussi.
On a en effet des pertes de L DH au cours des deux chromatographies : on ne sélectionne pas toute les fractions (par exemple, pour le pic 3 nous avons sélectionné seulement 2 fractions sur les 4 contenues dans le pic d’absorption : le rendement est divisé par deux). On remarque cependant que l’activité spécifique augmente au cours des étapes. L’AS correspond à l’activité de l’enzyme d’intérêt, la LDH, parmi toutes les autres protéines. Comme on est censé éliminer ces autres protéines au cours des chromatographies, il est logique que l’AS augmente.
Plus elle sera élevée, plus la protéine d’intérêt sera pure. En effet, le facteur de purification augmente ce qui révèle bien une purification (proportion de la quantité de protéine purifiée par rapport à la quantité initiale qui contient toutes les protéines). La ligne correspondant au pic 1 est particulière. En effet, ce pic contient toutes les protéines non fixées au ligand de la chromatographie d’affinité. Ainsi, comme il ne contient pas de LDH, l’activité catalytique est très proche de O tout comme son activité spécifique.
Ill / Electrophorèse 1) Méthodes L’électrophorèse est une méthode d’analyse et d’identification, basée sur la migration des particules chargées sous l’influence du champ électrique. Nous avons réalisé une électrophorèse en conditions natives : les différents isofarmes de la LDH ne sont pas dénaturés et sont séparées seulement selon leur cha 7 2 ifférents isoformes de la CDH ne sont pas dénaturés et sont séparées seulement selon leur charge (les poids moléculaires étant égaux).
Ils vont ainsi migrer plus ou moins loin vers la cathode (-) ou l’anode (+) en fonction de leur pHi. Tout d’abord, le gel d’agarose est préparé à 1% (O. 75g d’agarose pour 75mL de tampon) : il sera suffisamment discriminant pour voir la LDH (plus le pourcentage augmente plus le gel est sélectif). Le peigne est ensuite mis en place (en haut du gel) et après solidification, du tampon de migration à pH 8 est versé sur le gel et le peigne est retiré (12 puits créés). loin. En conclusion, le foie contient la LDH 4 et la CDH 5.
Pour le cœur, on observe 5 bandes pour les extraits bruts qui se retrouvent exactement au même endroit pour les puits contenant l’extrait purifié mals avec une plus faible intensité (les bandes paraissent moins colorées) : comme la coloration est spécifique de la LOH, on peut donc dire dans un premier temps, qu’on a perdu un peu de cette enzyme au cours de la purification. De plus, le cœur contient les 5 isoformes : la LDH 1, 2 et 3 ont migré vers l’anode (ils ont un pHi inférieur au pH du tampon donc ils ont chargés La CDH 1 correspond à la bande la plus proche de l’anode (son pHi étant le plus éloigné du pH 8).
La LDH 4 et 5 ont quant à elles migré vers la cathode comme pour le foie. IV / Etude cinétique Afin de réaliser une étude cinétique, nous avons utilisé plusieurs concentrations en substrat pour une concentration constante en enzyme. Nous avons utilisé des volumes plus importants pour les dilutions afin de posséder une marge d’erreur. La concentration mère en pyruvate est de 1 mM. La première dilution (0. 500) nous a senti à calibrer la manipulation afin de déterminer la dilution ? ffectuer pour la fraction de CDH purifiée : la pente mesurée doit être très proche de O. pour ainsi voir suffisamment les variations de vitesse avec l’effecteur. Après plusieurs essais, nous avons finalement dilué notre pic 3 au 12ème • 41. 5 PL de pic 3 dans 458,5 PL de tampon phosphate. On a ensuite suivi la variat nce rapidement après On a ensuite suivi la variation d’absorbance rapidement après ajout du pic 3 à 340 nm (longueur d’onde d’absorption du NADH+H+) pendant 30 secondes. On a réalisé la même manipulation selon les mêmes condltions pératoires en ajoutant cette fois-ci 15 PL d’un effecteur (P20) : l’acide oxamique (conservé dans la glace) et on a mesuré la variation d’absorbance pendant 30 secondes.
Après conversion des vitesses en pM/mn, on obtient une variation des vitesses en fonction de la concentration en pyruvate : représentation de Michaelis-Menten. Comme on ne peut pas déterminer avec précision le plateau (correspondant ? Vm), on a effectué une linéarisation en exprimant en fonction de (représentation de Lineweaver Burk) et on en a dédult les constantes cinétiques Km et Vm avec et sans effecteur. Sans effecteur Avec effecteur
