Années 2014-2015 Compte rendu TP Immunologie MISTOCO Glwadys MONTOUT Laura BSSI L2BB org Sni* to View Immunodiffusion Objectif du TP L’analyse des relations se créant entre les cellules du système immunitaire et les agents pathogènes sont établies à partir des tests d’immunodiffusion . Deux expériences, dont le principe consiste à la formation de complexes immuns anticorps- antigènes, ont été réalisées : immunodiffusion double d’Ouchterlony, dont l’objectif est de faire valoir la nature des substances mise en contact et donc de faire ressortir leur spécificité.
Analyse La concentration trouvée pour la solution A est supérieure ? celle de la solution 1 qul est la plus élevée dans notre gamme d’échantillons. On peut en déduire que la substance contenue dans le tube A possède une forte concentration d’antigène. La solution 3 présente une concentration qui rentre parfaitement dans la gamme et de ce fait une quantité moyenne d’antigènes. Conclusion On a réaliser le dosage d’un antigène (protéine), expérience qui nous a permis de déterminer la concentrations de solutions inconnues.
Méthode d’Ouchterlony Résultats Données :Les solutions des puits d’Ouchterlony sont l’Al : ac anti albumine bovine,l’A2 : albumine bovine (BSA), l’A3 : sérum bovin total dilué au 1/1 00, le BO : ac anti albumine bovine,
On remarque également le même précipité pour la figure C mais seulement entre l’anticorps Anti SBT Cl) et le BSA (C3). *AGF 9 rif q xpérience correspond à la formation de complexes immuns antigène-anticorps. Une réaction immunologique s’est établit entre les produits utilisés. Les anticorps anti albumine bovine ont réagit avec les substances albumine bovine et le sérum de bovin dans les figure A et g. Pour le système B, les antigènes étant tous de même nature, l’anticorps a réagi avec chacun d’entre eux en formant des petits arcs. ?tant très proches, nous supposons que ces arcs ont fusionné, c’est pourquoi l’on observe un précipité sous de cercle. Cependant, pour la figure A , les deux substances antigéniques ont différentes et pourtant les anticorps ont réagi avec chacun d’entre eux. L’antigène spécifique à cet anticorps est présent dans les deux solutions. On peut supposer que le sérum bovin total contient de l’albumine bovine (ASA). Dans la figure C, l’anti-sérum bovin total réagit avec la solution de BSA.
Donc les anticorps sont également spécifiques à l’antigene Mais on n’observe pas de précipité avec le sérum bovin total alors que celui réagit avec l’AC anti-3SA . Comme cette solution de sérum a été très dilué et se trouve en faible quantité, il se peut qu’il y ai eu formation mais très peu isible. Ainsi les anticorps anti BSA de Al, BO et Cl ont repérés des antigènes BSA et ont enclenché une réponse immunitaire.
On peut donc en déduire que l’albumine bovine et le sérum bovin, quelque soit leur concentration, possèdent des antigènes ESA. Cette m Cette manipu ation met en évidence le fait que le complexe immun ne se forme qu’entre les anticorps anti BSA et les solutions contenant des antigènes BSA. Cela met bien en évidence la spécificité de ces réactions et que donc un anticorps est spécifique à un antigène donné. Méthode Elisa Objectif C’est une autre méthode qui est également basée sur la formation des complexes antigènes-anticorps.
On recherche la présence d’anticorps anti BSA dans deux sérums inconnus. Données : Dans les différents puits de cette multiplaque, nous avons introduit un complexe d’anticorps (Ac primaire, Ac secondaire et Peroxydase) ainsi que plusieurs substances antigéniques dans la rangée A (témoin négatif rangée B (sérum de lapin), rangée C (sérum de mouton) et rangée D ( témoin positif). graphique nous constatons que les courbes des puits A et C ont des allures ascendantes mais avec des valeurs de Densité
Optique très faible, voir quasiment nulles dans le cas de C, alors que les courbes B et D ont des allures ascendantes et mais avec de forte valeurs de DO. Les antigènes possèdent plusieurs épitopes à leur surface et c’est sur ces éléments que se fixe les anticorps. Or un anticorps est spécifique d’un antigène donné. Disposant d’une solution très concentré d’antigènes pour une population d’anticorps plutôt restraint, nous avons effectué des dilutions de la solution antigénique de tel sorte à avoir plus de chance d’obtenir un grand nombre de complexes immuns.
Plus on dilue la solution Antigène, plus la quantité d’éléments pathogènes se rapproche de celle des anticorps de telle sorte ? ce que l’on obtienne dans un des puits autant d’antigène que d’anticorps et donc le maximum de complexes formés sera atteint (pic de densité optique). Après ce pic, on remarque que la valeur de densité optique diminue, nous supposons comme hypothèse que la faible population d’antigènes (dû à la dllution) face à celle des anticorps entraîne une diminution des systèmes immuns.
Pour revenir aux expériences effectuées dans les rangées A et C, lusieurs hypothèses pourraient expliquer l’absence de formation des systèmes notamment : l’absence du produit pathogène qui peut être dû à une erreur de manipulation, Soit nous avons oublié de mettre le produit dans ce une erreur de manipulation, Soit nous avons oublié de mettre le produit dans ce puits, soit nous l’avons introduit mais il n’y a pas eu d’adhésion entre antigène -anticorps et après le lavage il n’y avait plus de trace de l’antigène incompatibilité entre les deux éléments, l’anticorps utilisé ne reconnait l’agent pathogène et donc il ne possède une activité pécifique pour ce type de produit infectieux. La quantité de complexes AC-AG formés dépend de la concentration de l’Anticorps ou de l’antigène ( dans notre cas). En dilution, il y a plus de complexes crées et donc une forte activité enzymatique, Il se forme ce système que si l’ anticorps reconnaît spécifiquement l’agent pathogène auquel il est en contact. Donc une absence de formation entre ces deux entités suggèrent qu’ils ne sont pas spécifiques l’un à l’autre. Nous pouvons souligner que l’anticorps utilisé n’est spécifique qu’à lgG et le sérum de Lapin.
Il est fort possible que de ce sérum de lapin soit constitué de cette molécule d’IgG de lapin, Extraction de l’ADN avons passer notre échantillon d’ADN dans un spectophotomètre et après calculs nous obtenons une concentration d’ ADN de -3405 pg/ml et un rapport de pureté de 0,88. Notre concentration est négative ce qui voudrais dire qu’il y a eu des erreurs de manipulations qui peuvent être à l’origine de la contamination de notre produit (le manque de précision et de rigueur). En effet, un rapport de pureté de bonne qualité se situe ntre 1,8-2,0 ; on peut donc dire que notre ADN n’a pas été correctement extrait et est donc contaminé par des protéines. Digestion de l’ADN Nous mettons en contact de l’ADN avec des enzymes de restriction qui ont la capacité de couper en deux les sites spécifiques des molécules nucléiques.
A l’aide un marqueur de poids moléculaire nous devons déterminer, selon l’enzyme de restriction utilisée, la quantité d’ADN digérée d’après la distance de migration des fragments obtenus. Résultat raison de la présence des groupements phosphates, celui migre vers la borne plus ( la cathode). Cest ce que l’on remarque au niveau du quatrième puits, il n’y a pas de digestion mais juste une migration. (absence d’enzymes de restriction). Dans les puits contenant l’ADN eucaryotes, on n’observe aucun fragment d’ADN. On relève les distances de migration des fragments d’ADN par rapport à la ligne de dépôt pour chacun des puits. A l’aide de ces valeurs et de la fiche des marqueurs de poids moléculaire on réalise un graphique montrant la taille de fragments d’ADN selon la distance de migration.
Voir annexe 4 Sur le graphique , la courbe obtenue présente une allure escendante, selon les donnée du tableau on peut affirmer que plus les fragments d’ADN sont petits, plus la distance parcourue est grande. Si nous reportons sur cette courbe les distances de migration de fragments d’ADN, nous pouvons retrouver les tailles des fragment en paires de bases de la carte de restriction des enzymes Eco RI et Hind Ill. Nous avons : Distance de migration (en cm) Taille du fragment (en log) Taille du fragment (en Pb) 1,2 4,09 12303 3,95 tailles de fragments d’ADN après migration dans le puits 2 1,3 10000 3,82 6600 1,8 3,78 6025 2 3162 3,55 3548 2,7 2512 3,24 1738 1259 1000 2,86
