Enzymologie 1 Quelques définitions Enzymologie étude des enzymes Etymologie : Du grec en- (dans, à fintérieur de) et zumê (levain), car le levain contient des enzymes qui permettent la fermentation Terme introduit en 1876 par Kühne Première enzyme : diastase Elles ont presque toutes le suffixe -ase (=cliver) sauf la trypsine Tout ce qui est capable de catalyser une réaction chimique est une protéine, donc u Enzyme Catalyseur infime et qul accélèr la réaction est inchan Les catalyseurs biolo catalyseurs chimiques. or to View nextÇEge e concentration n, mais le résultat de us efficaces que les
La vitesse de la réaction est multipliée par 106 – 1012 ; et les conditions de réactions (température, pH sont plus douces. A la fin de la réaction, l’enzyme est intacte, inchangée . théoriquement on peut rutiliser indéfiniment, mais l’enryme peut se dégrader (pour la conserver il faut la fixer sur un support). une enzyme est spéclfique dune réaction. Isoenzymes : enzymes catalysant la même réaction sur le même substrat, mais ayant des structures protéiques différentes. Exemple : la CDH tétramérique possède 2 types de protomères (H et M).
Il en résulte 5 isoenzymes séparables par électrophorèse 1-44, *3M, H2M2, 1-43 et M4) La répartition des isoenzymes
Ions (exemple : atome de zinc de l’anhydrase carbonique) ou etites molécules minérales (exemple : H20, milieux biologiques) Certains cofacteurs = molécules + complexes synthétisés par la cellule = coenzymes Coenzyme : molécule biologique (synthèse uniquement dans les cellules vivantes) intervenant comme cofacteur indispensable dans la catalyse enzymatique d’une réaction. Lorsque la synthèse n’est pas inscrite dans le patrimoine génétique, alors la coenzyme doit être apportée par l’alimentation (aliment indispensable, exemple : vitamine) Coenzymes libres : se dissocient de l’enzyme a chaque réaction catalysée.
Coenzymes liés : ne se dissocient pas de l’enzyme. Lorsque les coenzymes sont liés aux enzymes par des liaisons électrostatiques ou + faibles, cette baison est renouvelée ? chaque réaction effectuée. Energie de liaison enzyme-coenzyme = Énergie de liaison enzyme- substrat Dans ce cas [coenzymes] doit être stoechiométrique (—du même ordre de grandeur que cel PAGF 8 est catalytique. Un des buts de l’enzymologie : déterminer la cinétique de la réaction enzymatique (vitesse : notlon essentielle ! Exemple : tas de pommes Vtl : 5 po/minVt2 : 4,9 po/min Vtx : 2 po/min V diminue au cours du temps pour un même mangeur V augmente avec la quantité de mangeurs V augmente avec la quantité de pommes accessibles jusqu’? saturation Quelques notlons de Chimie Les concentrations sont exprimées en M (mole. l_-l) Cinétique chimique : Etude des vitesses de réaction et de leurs modifications en réponse aux changements des conditions expérimentales Vitesse de réaction : variation de la concentration par unité de temps C] C]. t-l donc unité : M. in-l ou M. sec-l Réactions chimiques élémentaires . A+BDC+D Dans le cas d’une réaction élémentaire, la vitesse de réaction dépend de la vitesse de déplacement des particules (donc de la température) et de leur concentration V = kT. [A] . [B] kt = constante Réaction A + B (ordre 2) dépend de la vitesse des deux particules et de l’angle auquel les deux vont se rencontrer (choc efficace) 2A2C+D Résulte de la collision de 2 particules A (ordre 2) On mesure la disparation du réactif ou Papparition du produit (habituellement par spectroscopie).
Si on connaît le schéma réactionnel on peut donner l’équation de vitesse et avoir les constantes cinétiques qui caractérisent la réaction. Si on ne connaît pas le mécanisme de la réaction, on applique la notion d’ordre de la réaction : comment varie la vitesse de la éaction en fonction de la concentration du/des substrats ?
Ordre d’une réaction : puissance à laquelle la concentration d’un réactif doit être élevée dans l’équation de vitesse = Nombre de réactants dont la concentration aura une incidence sur la vitesse de réaction L’ordre de la réaction peut être classé en 2 catégories : ordre partiel : concerne un réactif donné ordre global : somme des ordres partiels A+B+CDP L’ordre de la réaction est a + p + y L’ordre de la réaction est déterminé par voie expérimentale. Détermination expérimentale de l’ordre d’une réaction par rapport à un réactif A
Les réactifs autres que A sont mis en excès (leur concentration est donc constante au cours de l’évolution de la réaction). Si on fait varier [A], on mesure la vitesse de réaction. On trace la courbe [A] f(t) et on détermine graphiquement la valeur de v en quelques points (la vitesse est déterminé par la pente). L’équation de la vitesse devient alors : v = k. (Ala ou ln v = ln k + a ln A On va donc pouvoir calculer k et surtout a 8 des réactifs. Dans ce cas, la vitesse de la réaction dépend de la concentration des catalyseurs et/ou de divers facteurs autres que la concentration des réactifs impliqués (ex : température)
La quantité de substrat diminue avec une pente linéaire (=stock de pommes). Le produit apparaît de façon linéaire également. ordre I Vitesse de réaction directement proportionnelle à la concentration d’un seul réactif. kordrel C t-1 donc s-l ou PAGF s 8 alors s’écrire : k’ constante de pseudo-premier ordre 0 s-l ou min-l Une réaction d’ordre 2 peut toujours être étudiée comme une réaction d’ordre 1 si l’un des deux réactifs est en large excès. Définition d’un équilibre chimique, expression de la constante d’équilibre.
Les réactions réversibles sont en état d’équilibre lorsque les éactions directe et inverse se font à la même vitesse. Un équilibre est caractérisé par sa constante d’équilibre (de formation) Ke Constantes d’équilibre et PAGF 6 8 vitesse totalement arbitraires, Depuis 1961 : l’IUB recommande l’emploi d’une « unité d’enryme » L’Unité Internationale Ul : quantité d’enzyme qui catalyse la transformation d’une micromole de substrat par minute dans des conditions définies. 1 Ul = 1 pmol. in-l 1966 : Une autre union internationale propose le catal (cat) 1972 : Le catal devient le katal (kat) qui correspond à la quantité catalytique d’un système qui catalyse suivant un schéma éactionnel décrit, la transformation d’une mole de substrat par seconde. 1 kat= 1 mol. s-l 1978 : On adopte le terme d’activité catalytique en katal Unité cohérente avec le système international (temps en sec, quantité de matière en moles) UI – lumol. min-l = 16,67 nmol. s. l = 16,67 nkat Mais utilisation plus pratique de l’UI pour définir une enzyme. plusieurs grandeurs peuvent être définies à partlr de l’activité catalytique .
L’activité spécifique Quantité de produit (en pmoles) formés / unité de temps (en général la minute) / mg de prot. – mesure du degré de pureté Sa valeur augmente au cours de la purification. Valeur max quand l’enzyme est pure. C] vmol/min/mg = Ul/mg Activité molaire Nombre de moles de substrat transformées / mole d’enzyme / m Inute 7 8 catalytique des enzymes dépend de l’intégrité de la conformation de la protéine native. Rôle essentiel des structures I II III et IV. 2) Spécificité des enzymes Du à l’adéquation de la configuration spatiale du substrat et celle de la partie fonctionnelle de l’enzyme.
Une enzyme ne catalyse qu’un seul type de réaction. Une enzyme n’agit que sur un seul substrat ou une classe de substrat : Speciflcité étroite : fenzyme ne transforme qu’un seul substrat Exemple : l’uréase (enz végétale) n’agit que sur l’urée (spécificité absolue) Spécificité large : l’enzyme agit sur une plus ou moins grande variété de substrat Exemple : la *D-galactosidase hydrolyse tous les p-D galactosides Les phospho-estérases hydrolysent les esters de l’acide phosphorique (spécificité de groupe) Stéréospécificité : l’enzyme distingue des isomères optiques ou des isomères Z et E.
Exemple : La fumarase (cf. cycle de Krebs) n’hydrate que l’acide fumarique isomère E (trans) et pas son isomère Z de Pacide maléique. Site actif (ou centre actif) : petite zone privilégiée de la protéine nzymatique dont la géométrie a une importance considérable sur la spécificité. Il est situé dans une zone hydrophobe (donc non exposée donc dans la partie interne) de l’enzyme. Le site actif assure deux fonctions . Fixation du substrat (site de fixation .
La plupart du temps par des liaisons électrostatiques o PAGF 8 8 conformation ainsi que celle du substrat (qui prend une conformation appelée état de transition). Les produits libérés sont différents de la conformation originelle du substrat mais l’enzyme reste identique et inchangée ! 3) Efficacité Pour chaque réaction, il y a une différence d’énergie libre et une arrière d’activation à franchir. Action de l’enzyme : abaisser l’énergie d’activation (enthalpie libre d’activation AG’). L’enthalpie libre réactionnelle AG reste inchangée en présence du catalyseur.
A chaque constante de vitesse correspond une énergie d’activation (plus AG’ est grande, plus k est petite) La différence d’énergie libre (AG) entre substrat et produit ne dépend pas de l’enzyme. L’équilibre n’est donc pas modifié par l’enzyme ! On mesure l’efficacité catalytique de renzyme en mesurant la diminution de Vénergie d’activation. Exemple de l’efficacité de la catalyse enzymatique : écomposition du peroxyde d’h dro ène 2 H202 2 H20 + 02 la droite, la solution clivée dévie la lumière vers la gauche (d’où le nom de l’enzyme invertase).
Les deux enzymes donnent le glucose et le fructose (sucre clivé), mais historiquement on a observé le changement de déviation du plan de la lumière polarisé avec la p-fructosidase. La a- glucosidase peut être appelée saccharase. Observation : lorsque [saccharose] > [enzyme], la vitesse de réaction devient indépendante de la concentration (ordre O). Proposition : réaction globale composée de plusieurs réactions élémentaires Ily a au moins 3 réactions simples
Fixation du substrat (S) sur l’enzyme (E), formation du complexe Transformation du substrat lié (ES) en produit lié CEP) Dissociation du complexe (EP), largage du produit (P) Equation de Brown : Ici aussi, la vitesse de réaction est difficile à mesurer en présence de S et de p, surtout à l’équilibre ! On mesure donc de préférence en déséquilibre total, c. à. d. la vitesse initiale. Le schéma se simplifie (plus que 3 constantes) : Traitements cinétiques 2 hypothèses : équilibre rapide état stationnalre pour les 2 hypothèses : mêmes suppositions de départ Formation réversible d’un complexe entre l’enzyme et son
