MOTTE Amelina Monico Julien 03/2011 Etude de l’effet d’un ralentissement metabolique sur le fonctionnement de la pompe Na+/K+ ATPase DEPENDANTE Comme nous le savons aujourd’hui, la survie des cellules depend de leur capacite a controler les mouvements d’eau au travers de la membrane plasmique. Il s’agit ici pour la cellule de mettre en place un equilibre osmotique, ceci se fait par l’intermediaire d’une pompe dite Na+/K+/ATPase dependante.
Dans un premier temps, nous avons verifie, en conditions standards, que les ions Na+ sont bien le principal cation extracellulaire et les ions K+ le principal cation intracellulaire. Nous avons fait ceci par HPLC ionique. Dans un deuxieme temps, nous avons etudie l’effet que pouvait produire un ralentissement metabolique sur le fonctionnement de la pompe Na+ K+ ATPase. Nous avons fait ceci en conservant et en travaillant nos echantillons au froid. Ceci ayant pour but de montrer que le pompage de Na+ vers le milieu exterieur contre le gradient de concentration necessite de l’energie.
Les concentrations en Na+/K+ intra et extra cellulaire seront encore mesurees par HPLC ionique. Pour finir, nous avons egalement determine la concentration en hemoglobine dans les conditions standards et dans les conditions de conservation a froid, afin de voir que la structure
Fig1 : Schema du fonctionnement de la pompe 154mM 4mM 12mM 140mM Nous allons mesurer les concentrations Na+/K+ intra et extracellulaires dans des conditions standards, dans des hematies de lapin, ce qui nous permettra de verifier les concentrations theoriques physiologiques que les cellules possedent (fig. 1). Puis nous remesurerons ces concentrations apres conservation au froid (ceci nous permet de ralentir le metabolisme et de voir si des mouvements d’ions sont toujours observes lorsqu’il y a faible production d’ATP).
Le but est donc de savoir si la pompe ATPase joue bien un role et son implication dans la modification des concentrations en ions de la cellule, cette experience nous permettra aussi de voir si lorsque l’on arrete cette pompe il y a d’autres mecanismes qui prennent le relais ou alors on a une accumulation stable de ion intra et extracellulaire. 1 MOTTE Amelina Monico Julien 03/2011 MATERIEL ET METHODES Le protocole suivant recapitule les etapes importantes de l’experience faite sous deux conditions, a temperature ambiante et a froid (4°C).
Les cellules utilisees sont des globules rouges car ils n’ont pas de noyau, ce sont des cellules simples et faciles a obtenir. Deux techniques essentielles ont ete utilises dans les experiences pour obtenir nos resultats ce sont l’HPLC et la spectrophotometrie Principe HPLC : Technique physique de separation d’especes chimiques. L’echantillon est entraine par un courant de phase mobile le long d’une phase stationnaire, chaque espece se deplace a une vitesse propre dependante de ses caracteristiques et de celles des deux phases.
Principe spectrophotometrie : Methode analytique quantitative qui consiste a mesurer l’absorbance d’une substance chimique donnee en solution. Plus cette espece est concentree plus elle absorbe la lumiere dans les limites de proportionnalites enoncees par la loi de Beer-Lambert. RESULTATS : Les differentes valeurs experimentales des concentrations en ions ont ete corrigees pour prendre en compte les differentes contaminations survenues lors des lavages et par des produits joutes tels que le tampon Choline, la solution de Ringer, ou encore l’hemoglobine (Hb) liberee dans le milieu suite a l’explosion des globules rouges et ainsi faisant varier les concentrations extracellulaires plasmatiques. 2 MOTTE Amelina Monico Julien 03/2011 Tab 1 : Concentration des ions intracellulaire et extracellulaire n=5 MOYENNE ECART TYPE MOY-2*ET MOY+2*ET STAT EXTRACELLULAIRE [Na+] en mg/mL [K+] en mg/mL t° ambiante t° 4°C t° ambiante t° 4°C 87,7 90,0 7,5 17,6 4,0 36,4 0,5 5,9 79,6 17,1 6,5 5,9 95,8 162,9 8,5 29,3 0,45 0,01
INTRACELLULAIRE [Na+] en mg/mL [K+] en mg/mL t° ambiante t° 4°C t° ambiante t° 4°C 6,0 8,3 25,5 14,1 1,4 4,8 11,9 8,4 3,2 -1,3 1,7 -2,7 8,8 17,8 49,3 30,9 0,16 0,10 Le tableau 1 montre les differentes concentrations intra et extracellulaires des ions Na+ et K+ a temperature ambiante et a froid (4°C). On observe une difference significative au niveau de [K+] extracellulaire qui augmente suite a l’experience a 4°C. Ce resultat est soutenu par le test de Student, qui permet de determiner statistiquement la fiabilite de la comparaison entre deux resultats (ligne STAT).
La valeur est de 0,01 inferieur a la valeur seuil de 0,05, Pour les autres concentrations intra et extra cellulaire, les moyennes des valeurs sont plutot similaires. Fig. 2 : Diagramme de concentration des ions extra et intracellulaire a temperature ambiante et a 4°C Comparaison des concentration en Na+ K+ dans les milieux extra et intracellulaires a temperature ambiante et a 4°C Concentration en ion (mg/mL) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Na+ Na+ Ambiante 4°C K+ K+ K+ Na+ Na+ K+ EXTRACELLULAIRES INTRACELLULAIRES
Sur la figure 2, les concentrations en Na+ et K+ sont reparties selon leur localisation (intra ou extracellulaire) et selon les temperatures auxquelles ont ete faites les experiences (temperature ambiante ou 4°C). On voit qu’en proportion, dans le milieu extracellulaire, l’ion Na+ est majoritaire sur l’ion K+ avec environ 90 mg/mL. A l’inverse, dans le milieu intracellulaire, c’est l’ion K+ qui est majoritaire sur Na+. Si l’on compare [Na+] extracellulaire et [K+] intracellulaire, on voit que la concentration de Na+ est plus importante que celle de K+.
A 4°C, on a toujours une concentration [Na+] superieure a [K+] dans le milieu extracellulaire avec environ 90mg/mL contre 20mg/mL. Dans le milieu intracellulaire l’ion majoritaire est K+ avec environ 15 mg/mL contre 9mg/mL de Na+. Si l’on compare les concentrations a temperature ambiante et a 4°C, on observe qu’a 4°C, la concentration extracellulaire de K+ augmente significativement (20 mg/mL contre 9mg/mL) et celle de K+ intracellulaire diminue (15mg/mL contre 25mg/mL). Les concentrations en Na+ restent relativement stables. MOTTE Amelina Monico Julien 03/2011 Tab 2 : Concentration [Hb] dans les globules rouges et dans le plasma. [Hb] P (plasma) [Hb]GR (globules rouges) t° ambiante t° 4°C t° ambiante t° 4°C MOYENNE 1,0 7,9 139,0 159,5 ECART TYPE 1,4 4,1 147,8 98,7 MOY-2*ET -1,8 -0,4 -156,5 -37,9 MOY+2*ET 3,7 16,1 434,6 357,0 STAT 0,01 0,37 Fig. 3 : Diagramme de [hemoglobine] extra et intracellulaire a temperature ambiante et a 4°C Comparaison des [hemoglobine] dans le plasma et les globules rouges a temperature ambiante et 4°C
Fig. 4 : Dessin des observations microscopiques des globules rouges au X100 a temperature ambiante et a 4°C T°C Amb : Globule rouge turgescent 1000 Pourcentage de la [Hemoglobine] 800 600 400 200 0 4°C : Globule rouge crenele P GR Globule rouge turgescent L’evolution de [Hb] du plasma augmente de maniere significative a froid passant de 0,96 mg/mL a 7,86 mg/mL alors que la concentration en Hb des globules rouges reste plutot stable au cours du temps (aux alentours de 145 mg/mL).
A l’observation microscopique, on voit des globules rouges turgescents a temperature ambiante, et a 4°C, on voit des globules rouges turgescents et d’autres creneles. DISCUSSION ET CONCLUSION : La comparaison entre les resultats theoriques de concentrations attendues en ions (Fig. 1) et nos resultats (Tab 1) montre que les concentrations de nos echantillons sont plus faibles en ions Na+ extra et K+ intra par rapport aux valeurs theoriques.
On peut l’expliquer par des erreurs de manipulations par exemple, les dilutions que l’on a fait au cours de l’experience et peut-etre une difference entre l’etat in vivo et in vitro, les pompes peuvent fonctionner moins bien. Les proportions restent neanmoins plutot respectees. A froid, on a peu de modifications des concentrations des ions Na+ (Tab1, Fig2) en comparaison aux concentrations a temperature ambiante (Fig2). L’arret de la pompe NaATPasique semble donc entrainer une accumulation des ions Na+ dans les differents compartiments, il n’y a plus de passage possible pour eux.
La sortie de Na+ vers le milieu extracellulaire n’a plus lieu (Fig. 1). 4 MOTTE Amelina Monico Julien 03/2011 Dans le cas des ions K+, on observe des variations de concentration entre les conditions de froid et de temperature normale (Tab 1). Il semble donc qu’il y ait des modifications, d’autres mecanismes qui permettent le passage de ces ions. On peut imaginer par exemple, que l’accumulation de charge dans la cellule peut creer des radicaux libres faisant des trous dans la membrane. La formation de ces pores permettant alors le passage des ions K+.
De plus, le fait que seule la concentration de K+ varie avec augmentation intracellulaire et diminution extracellulaire va dans le sens de la theorie (Fig. 1) avec une entree de K+ vers la cellule a partir du milieu extracellulaire. Cette hypothese peut etre appuyee par l’observation des cellules au microscope qui montre qu’en majorite a temperature ambiante, on a des cellules turgescentes, rondes alors que l’on a apparition de cellules crenelees (environ 10% de la population) au milieu de cellules turgescentes a 4°C et donc ralentissement du metabolisme (Fig 4).
A priori, ce n’est pas l’eau qui se deplacerait puisque dans ce cas la, on aurait un gonflement des cellules, ce qui n’est pas le cas ici. Les variabilites des concentrations en hemoglobine (Tab 2), peuvent s’expliquer par les erreurs de manipulation et l’eclatement de certaines cellules qui ont pu contaminer le milieu extracellulaire. La concentration en hemoglobine plasmatique augmente a froid peut s’expliquer par des globules rouges qui ont eclate, entrainant la contamination des concentrations en ions.
Meme si ca represente un faible facteur [Hb]plasmatique(4°)/[Hb]GR(4°) = 14,1/254,1=0,055, il faut le prendre en compte car cela montre qu’il y a bien des variations apres mise au froid. Cet eclatement, qui n’est pas sense avoir lieu en absence de gonflement des cellules, peut etre du a une mauvaise qualite du sang ou a des problemes lies a la manipulation tel que le fait de souvent homogeneiser car le sang sedimente rapidement ou encore de pipeter le sang. 5
