These de microbiologie

These de microbiologie

N° d? ordre 001-2009 Annee 2009 THESE DE L„UNIVERSITE DE LYON Delivree par L? UNIVERSITE CLAUDE BERNARD LYON 1 EVOLUTION, ECOSYSTEMES, MICROBIOLOGIE, MODELISATION (E2M2) DIPLOME DE DOCTORAT (arrete du 7 aout 2006) Soutenue publiquement le 15 janvier 2009 Par Mr Dulermo Thierry Transfert du carbone au cours de l’infection du tournesol par le champignon necrotrophe B. cinerea : des hexoses de la plante au mannitol fongique Directeur de these : Mme Pascale Cotton JURY Mme Nicole Cotte-Pattat Mme Pascale Cotton Mme Sabine Fillinger Mme Micheline Wesolowski-Louvel Mr Richard Bligny Mr Alain Pugin

MINISTERE DE L’EDUCATION FORMULAIRE D’ENREGISTREMENT REMERCIEMENTS Bien que les remerciements soient places au niveau des premieres pages de ce manuscrit ils me rapprochent plus que jamais de la fin de ma these. Que dire, si ce n? est que j? ai passe 3 merveilleuses annees en these et que je dois ce bonheur a de nombreuses personnes. J? aimerais commencer par remercier toute ma famille qui a toujours ete la pour m? encourager meme si pour beaucoup il est difficile de comprendre ce que l? on fait en recherche. J? spere que ma soutenance orale leur permettra de comprendre ce qu? a ete mon travail. Je remercie tout particulierement ma

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maman pour son amour et sans qui je n? aurais jamais ete la, mon frere jumeau Remi, dont je suis tres fier et qui passera sa these en biologie dans moins d? un an (avec brio j? en suis persuade). J? aimerais ensuite remercier chaleureusement mon grand frere, Didier et ma belle-s? ur, Vanessa, pour leur soutient inconditionnel, pour m? avoir guide dans mes choix et pour avoir toujours ete la pour m? aider quand j? en avais besoin.

Je souhaite laisser un petit message a mon tres cher neveu, Arthur, qui du haut de ses 6 ans est un petit amour de gamin, deja tres erudit et qui pourrait pourquoi pas un jour se retrouver a presenter une these. Merci donc a toute ma famille pour leur amour. J? aimerais remercier aussi mes amis, Anthony, avec qui j? ai fait une bonne partie de mes annees de fac, sa futur femme Nelly qui a toujours ete adorable, David pour ta gentillesse et ton amitie depuis la classe de seconde et enfin John, Bernard et Gigi qui ont toujours ete comme une deuxieme famille pour moi.

Quelques lignes maintenant, destinees a mes collegues de travail du « groupe carbone ». Pascale, je voudrais te remercier pour m? avoir fait confiance il y a 3 ans et pour m? avoir toujours soutenu et aide tout au long de ma these. Arrivant du DEA, je manquais de confiance en moi et a ton contact j? ai appris a prendre confiance en moi et a defendre fermement ce a quoi je croyais. Merci pour tout ce que tu m? as apporte. Que serait le groupe carbone sans notre Christine. Sans toi, CriCri, je n? aurais pas fait tout ce que j? ai fait.

Je te remercie donc pour ton aide de tous les jours et pour ta bonne humeur quotidienne. J? ai beaucoup apprecie de travailler avec vous et je pense sincerement que nous formions une tres tres bonne equipe. Une partie de mes travaux de these ont ete effectue au CEA a Grenoble. Que dire si ce n? est que mes sejours se sont toujours merveilleusement bien passes. J? ai eut l? occasion de rencontrer deux personnes que j? admire beaucoup. Je parle bien sur de toi Richard et de toi Elisabeth. Vous etes vraiment des scientifiques dans son sens le plus profond.

A chacun de mes sejours Grenoblois vous avez toujours ete disponible et d? une gentillesse infinie. Je garderais toujours en memoire les multiples conversations ou nous philosophions et refaisions le monde. 2 Depuis mon arrive au labo, le 1er octobre 2005, j? ai toujours pris un tres grand plaisir a venir travaille. Je dois cela non seulement a ma passion pour la biologie mais aussi a toutes les personnes travaillant au labo et qui rendent l? ambiance de notre lieu de travail si agreable. Mes souvenirs des sorties de labo, de nos repas de fin ou de milieu d? nnee resteront graves dans ma memoire comme des moments tres agreable. Un merci special a : Concetta, pour tes delicieux desserts et ta bonne humeur. Vincent, pour t? etre prete a mes deconnades et pour ta gourmandise qui m? a permis de ne jamais complexer en ce qui concerne mes copieuses assiettes de desserts. BiBi, pour ta gentillesse et nos discussions autour d? une tasse de the. Mathias pour sa gentillesse et sa bonne humeur communicative. Christophe, pour nos discussions socialo-mondio-politico-economiques. Nathalie, pour ta gentillesse et nos discussions aussi bien scientifiques que non scientifiques.

A toute l? equipe de Conidia, Seb, Cathy, Cindy, Jean-Louis, Claire et Claude. Enfin j? aimerais remercier nos collegues de Bayer et plus particulierement Philippe qui nous as quitte il y a peu pour l? Allemagne, et Francois pour nos batailles d? eau memorables, Crystel, Viviane et Benedicte pour leur sourire au quotidien. Si j? ai bien calcule, les etudiants du labo doivent etre en train de se dire que je les ai oublies. Et bien non, comment oublier nos fous rires, nos sorties et nos soirees passees chez Heber !!!

Un grand merci a : – Heber, pour ta gentillesse, ta bonne humeur, tes conseils et ton humour version «mexicaine». J? espere que ton post doctorat en Californie se passera bien et que cela te permettra de retrouver le soleil qui te manquait tant. – Ma petite Laetitia, merci a toi, tu es un vrai catalyseur du rire et de la bonne humeur dans notre labo, j? espere que ta these se passera aussi bien que pour moi et Heber. – Patricia, qui passera sa these d? ici peu. Tu es l? une des personnes avec qui je me suis le mieux entendu a la Dargoire.

J? ai beaucoup apprecie ta gentillesse et ta compagnie que je regrette d? avoir decouvert lors de ma derniere annee, apres notre demenagement sur le site de la Dargoire. – Yann, qui a perpetuellement un grand sourire visse au visage. Merci pour tout ce que tu as fait pour essayer de reunir les etudiants de l? unite et pour ton amitie. – Gaetan, pour ton tres bon stage, ta joie de vivre. J? espere que tu trouveras bientot du travail ;-). Je garderais en memoire les discussions que nous avions a propos, entre autre, des ragots du laboratoire.

Nous avions, je pense, forme le premier groupe de paparazzis scientifiques. Deja 3 pages et je n? ai pas encore remercie mes collegues de la toute recente unite 5240. Je me souviens tres bien de mon premier stage, lors de ma Maitrise. Je l? avais effectue, au 3 ieme etage du batiment Lwoff, avec Jean-Claude et Anne. J? en garde un tres bon souvenir et je voudrais vous remercier pour m? avoir donne les bases au niveau des manips de biologie moleculaire et de m? avoir donne l? envie de poursuivre dans ma voie. J? ai ensuite effectue mon DEA, au deuxieme etage de ce meme batiment, avec Marc et Micheline. Avec le recul, je me dis que je n? etais pas tres debrouillard a l? epoque et que j? ai beaucoup murit et progresser depuis. Je voudrais donc vous remercier, Micheline et Marc, pour m? avoir accueillit pendant pres d? un an dans votre equipe. Et je remercie Micheline pour avoir accepter de faire partie de mon jury de these. Ma these ayant debute au rez-de-chaussee du batiment Lwoff, j’en conclus que plus j’avance et plus je descends les etages !!! J? espere que je ne ferais pas un post doctorat dans une cave.

Je souhaiterais remercier les differents membres du jury pour avoir accepte d? evaluer mon travail. Je souhaitais garder ce dernier paragraphe pour une personne qui illumine ma vie depuis bientot 1 an et avec qui j? aimerais construire mes annees futures. Mon amour qui vit tres loin de moi mais qui va bientot partager ma vie en France. Bientot les 12 000 km qui nous separent ne seront plus. Je te remercie Hui pour l? amour que tu me porte chaque jour malgre la distance et ton soutient inconditionnel. Tu m? as ouvert de nouveaux horizons et tu m? s permis de comprendre que la these et la science c? est bien mais que l? amour est plus important que tout. Je ferais tout ce qui est en mon pouvoir pour te rendre heureuse et pour que ton beau sourire ne s? efface jamais. 3 ABBREVIATION ADN : acide desoxyribonucleique ADNc : acide desoxyribonucleique complementaire ADNg : acide desoxyribonucleique genomique AMPc : adenosine monophosphate cyclique ARN : acide ribonucleique ATP : adenosine triphosphate DHA : dihydroxyacetone DHAP : dihydroxyacetone phosphate DPG : di phosphatidyl glycerol EST : sequence d?

ADNc F6P : fructose-6-phosphate FW : poids frais G3P : glycerol-3-phosphate G3PDH : glycerol-3-phosphate deshydrogenase G6P : glucose-6-phosphate GABA : acide gamma-amino butyrique GDH : glycerol deshydrogenase GFP : proteine fluorescente verte GPC : glycerol phosporyl-choline Hpi : heure apres infection HOG : glycerol a haute osmolarite HR : reponse hypersensible Hxt : hexoses transporteur LDR : deshydrogenase a chaine longue M1P : mannitol-1-phosphate MAPK : proteine kinase activant la mitose MDR : deshydrogenase a chaine moyenne MFS : major facilitator superfamily MPD : mannitol-1-phosphate deshydrogenase MTDH: mannitol deshydrogenase PCA : acide perchlorique PCR : amplification en chaine par polymerase PC : phosphatidyl choline PE : phosphatidyl ethanolamine PG : phosphatidyl glycerol PI : phosphatidyl inositol PPP : voie des pentoses phosphates PR (proteine) : proteine associee a la pathogenese PS : phosphatidyl serine ORF : cadre ouvert de lecture Q-PCR : amplification en chaine par polymerase quantitative RMN : resonance magnetique nucleaire ROS : espece activee de l? xygene SD : deviation standard SDR : deshydrogenase a chaine courte UDP-GlcNAc : Uridine-5? -diphosphate-N-acetylglucosamine UV : ultra violet T6P : trehalose-6-phosphate T6PS: trehalose-6-phosphate synthase TLC : chromatographie sur couche mince TM : traversee membranaire WT : sauvage 4 1 TABLE DES MATIERES ABBREVIATION TABLE DES MATIERES 2 2 A – EXPOSE BIBLIOGRAPHIQUE I – INTRODUCTION II – MODES TROPHIQUES DES CHAMPIGNONS EN INTERACTION AVEC LES PLANTES 6 7 II. 1 – La symbiose mycorhizienne II. 2 – Les champignons biotrophes II. 3 – Les champignons necrotrophes: modele d’etude Botrytis cinerea II. 3. 1 Cycle infectieux et conditions d? infection II. 3. Une strategie d? attaque basee sur un arsenal enzymatique et la secretion de toxines II. 4 – Les champignons hemibiotrophes III. 1 – Les transporteurs d’hexoses chez Saccharomyces cerevisiae III. 1. 1 Generalite sur les transporteurs de sucres III. 1. 2 Transport des hexoses chez S. cerevisiae III. 1. 3 Caracteristiques des transporteurs d? hexoses de S. cerevisiae III. 1. 4 Specificite de transport et d? affinite III. 1. 5 Regulation transcriptionnelle des transporteurs d? hexoses de S. cerevisiae III. 2 – Les transporteurs d’hexoses chez les champignons filamenteux III. 2. 1 Champignons filamenteux saprophytes III. 2. 2 Champignons mycorhiziens III. 2. Champignons pathogenes des plantes III. 3 – Invertases fongiques 9 12 14 18 21 14 16 9 III – ASSIMILATION DES HEXOSES PAR LES CHAMPIGNONS 20 21 22 22 25 25 26 27 29 26 30 IV – ROLES DES POLYOLS ET DES SUCRES INTRACELLULAIRES SOLUBLES CHEZ LES CHAMPIGNONS FILAMENTEUX IV. 1. 1 Metabolisme du trehalose chez la levure S. cerevisiae 33 IV. 1. 2 Metabolisme du trehalose chez le champignon saprophyte A. nidulans 34 IV. 1. 3 Importance du trehalose dans le processus infectieux du champignon hemibiotrophe M. grisea 34 IV. 1. 4 Metabolisme du trehalose chez le champignon necrotrophe B. cinerea 37 IV. 2 – Metabolisme du glycerol 38 IV. 2. 1 Metabolisme du glycerol chez la levure S. erevisiae 38 IV. 2. 2 Metabolisme du glycerol chez le champignon saprophyte A. nidulans 39 IV. 2. 3 Accumulation de glycerol dans les appressoria du champignon hemibiotrophe M. grisea 40 IV. 2. 4 Accumulation de glycerol au cours de l? infection du tournesol par le champignon necrotrophe S. sclerotiorum 41 IV. 2. 5 Voies de signalisation Bos1 chez le champignon necrotrophe B. cinerea 42 IV. 3 – Metabolisme de l’arabitol 43 IV. 3. 1 Metabolisme de l? arabitol chez les champignons filamenteux 43 IV. 4 – Metabolisme du mannitol 45 IV. 4. 1 Donnees enzymologiques et structurales concernant les enzymes MPD et MTDH chez les champignons filamenteux 46 IV. 4. Accumulation de mannitol dans les spores des champignons saprophytes et protection contre le stress 48 IV. 4. 3 Le mannitol, une voie incontournable pour l? assimilation du glucose et la redistribution du flux carbone chez les champignons mycorhiziens 49 IV. 4. 4 Role du mannitol chez les champignons pathogenes des plantes 49 32 2 IV. 5 – Roles du trehalose et des polyols chez les champignons V – MODIFICATIONS DU METABOLISME PRIMAIRE AU COURS DE L’INFECTION DES PLANTES PAR LES CHAMPIGNONS PATHOGENES 52 V. 1 Effet des biotrophes sur le metabolisme des plantes V. 2 Effet des hemibiotrophes sur le metabolisme des plantes V. 3 Effet des necrotrophes sur le metabolisme des plantes 53 53 55 56 B – PROJET DE RECHERCHE

I – OBJECTIFS DU PROJET DE RECHERCHE II – PROCESSUS METABOLIQUES AU COURS DE L’INFECTION DU TOURNESOL PAR B. CINEREA ET M. GRISEA 61 62 II. 1 – Article 1: Dynamic carbon transfer during pathogenesis of sunflower by the necrotrophic fungus Botrytis cinerea: from plant hexoses to mannitol (submitted to New Phytologist) 64 II. 1. 1 Summary 64 II. 1. 2 Introduction 65 II. 1. 3 Material and Methods 67 67 67 68 68 70 II. 1. 4 Results 71 II. 1. 4. 1 Metabolic spectra of infection partners and NMR profiling during plant colonization 71 II. 1. 4. 2 Expression of fungal nutrition genes 73 II. 1. 4. 3 Expression of the mannitol pathway during sunflower cotyledon infection 76 II. 1. 4. Dynamic analyzes of carbon nutrition in B. cinerea by in vivo NMR spectroscopy and [1-13C]glucose and [2-13C]fructose labelling 78 II. 1. 5 Discussion 79 II. 1. 5. 1 Disappearance of plant carbohydrate stores 79 II. 1. 5. 2 Expression of a complex hexose uptake system 80 II. 1. 5. 3 Glucose and fructose allocation by B. cinerea 82 II. 1. 3. 1 II. 1. 3. 2 II. 1. 3. 3 II. 1. 3. 4 II. 1. 3. 5 Fungal strain and growth conditions Pathogenicity tests Construction of the phylogenetic tree RNA isolation and Q-PCR NMR Spectroscopy 64 II. 2 – Donnees complementaires non publiees II. 2. 1 Materiels et Methodes II. 2. 1. 1 Souches fongiques et conditions de culture II. 2. 1. Materiel vegetal et tests de pathogenicite II. 2. 1. 3 Extraction des ARN totaux des plantes infectees II. 2. 1. 4 Spectrometrie RMN 85 II. 2. 2 Modifications du profil des phospholipides au cours de l? infection du tournesol par B. cinerea 89 II. 2. 3 Modifications transcriptionnelles des genes de defense et du metabolisme du tournesol au cours de l? infection par B. cinerea 90 II. 2. 4 Analyse metabolique de l? infection de l? orge par le champignon hemibiotrophe Magnaporthe grisea 91 II. 2. 4. 1 Profils metaboliques des partenaires de l? infection: orge et M. grisea 91 II. 2. 4. 2 Modifications metaboliques au cours de l? infection de l? orge par M. grisea 92 II. 2. 4. Analyse transcriptionnelle des genes de biosynthese du mannitol chez M. grisea au cours du processus infectieux 93 III – ARTICLE 2: EXPLORATION OF THE MANNITOL PATHWAY IN THE FUNGAL PLANT PATHOGEN BOTRYRIS CINEREA (non soumis) 85 85 85 85 86 III. 1-Summary III. 2-Introduction III. 3 -Material and Methods 95 96 97 95 3 III. 3. 1 Fungal strain and growth conditions III. 3. 2 In vitro germination and conidiation assays III. 3. 3 Pathogenicity tests III. 3. 4 Plasmids construction and transformation of B. cinerea III. 3. 5 RNA isolation and transcripts quantification III. 3. 7 Mannitol quantification during development and response to osmotic stress III. 3. Development of antibodies against BcMPD and BcMTDH III. 3. 9 Western Blot analysis III. 4-Results III. 4. 1 Deletion of Bcmpd and Bcmtdh genes III. 4. 2 Characterization of ? Bcmpd and ? Bcmtdh mutants strains III. 4. 3 Determination of the metabolite levels in vitro III. 4. 4 Conversion of hexoses by BcMPD and BcMTDH pathways III. 4. 5 Mannitol mobilization during in vitro development of B. cinerea III. 4. 6 Mannitol mobilization during osmotic stress response III. 4. 7 Bcmpd deletion mutant, as a tool to reveal a mannitol phosphorylation pathway in B. cinerea III. 5-Discussion III. 5. 1 B. cinerea mannitol deficient strains present a modified carbohydrate profile III. 5. Bcmpd and Bcmtdh mutants are not affected for in vitro and in planta development III. 5. 3 Mannitol is transiently degraded during osmotic stress response in B. cinerea III. 5. 4 Mannitol phosphorylation pathway leads to the end of mannitol cycle 103 97 98 98 98 100 101 102 102 103 104 105 106 107 108 110 109 110 112 113 114 C – DISCUSSION ET PERSPECTIVES I – Modifications metaboliques au cours de la pathogenese necrotrophe II – Metabolisme du mannitol chez B. cinerea 116 117 119 D – REFERENCES 125 4 TABLE DES FIGURES ET DES TABLES Figures Figure 1: Echanges entre une plante et un type de mycorhize (l? ectomycorhize). Figure 2: Structures ectomycorhiziennes.

Figure 3: Structures endomycorhiziennes. Figure 4: Symptomes foliaires observes lors de l? infection par differents champignons biotrophes. Figure 5: Etapes de l? infection par Uromyces fabae (forme dicaryon). Figure 6: Impacts de B. cinerea sur les differents organes des vegetaux. Figure 7: Cycle de developpement de B. cinerea. Figure 8: Structure de la paroi vegetale. Figure 9: Le botrydial. Figure 10: Test de pathogenie sur feuille de haricot des souches sauvages de B. cinerea … Figure 11: Etapes d? infection chez les champignons hemibiotrophes. Figure 12: Representation tridimensionnelle de la proteine GlpT de Escherichia coli de type MFS.

Figure 13: Topologie predite et motifs conserves de differents transporteurs d? hexoses fongiques. Figure 14: Schema representant la topologie predite des senseurs de glucose Rgt2p et Snf3p … Figure 15: Tests de complementation fonctionnelle de mutants deficients dans l? import d? hexoses … Figure 16: Modele de l? adaptation physiologique des champignons ectomycorhiziens a la … Figure 17: Localisation spatiale des transcrits Ufhxt1 et de la proteine UfHXT1 d? U. fabae. Figure 18: Localisation spatiale des transcrits Uf-INV1 et de la proteine Uf-INV1 d? U. fabae. Figure 19: Schema des differentes voies de biosyntheses du trehalose, du glycogene et des … Figure 20: Metabolisme du trehalose chez les champignons.

Figure 21: Phenotypes de la souche ? tps1 de M. grisea. Figure 22: Expression de MgNTH1 fusionne a la GFP au cours de la conidiogenese et de l? infection. Figure 23: Metabolisme du glycerol chez les champignons. Figure 24: Expression des genes gldB et gfdA d? Aspergillus nidulans au cours d? un stress … Figure 25: Test de croissance de la souche sauvage et de mutants ? gldB. Figure 26: Spectres RMN (abondance naturelle 13C) du mycelium pur de S. sclerotiorum … Figure 27: Diametres des necroses au cours de l? infection de feuilles de haricot intactes … Figure 28: Metabolisme de l? arabitol chez les champignons. Figure 29: Localisation spatiale des transcrits UfARD1 d? U. fabae.

Figure 30: Metabolisme du mannitol chez les champignons Ascomycetes. Figure 31: Modelisation tridimentionnelle de la structure tertiaire et quaternaire de … Figure 32: Severite des lesions au cours de l? infection du tabac par A. alternata. Figure 33: Modification de la concentration de quelques acides amines et du nitrate au … Figure 34: Impact des polyamines dans l? infection du tabac par S. sclerotiorum. Figure 35: Expression des genes Lin6, Pr1, Pal et RbcS au cours de l? infection de feuilles … Figure 36: Effet du ComCat sur l? infection des feuilles de tomate par B. cinerea. Figure S1: Proton-decoupled 13C-NMR spectra of PCA extracts of B. cinerea mycelium, H. nnuus … Figure 37: Proton-decoupled 31P-NMR spectra of PCA extracts of sunflower cotyledons … Figure 38: Phylogenetic relationships of the deduced protein sequences of the B. cinerea … Figure 39: Expression of members of the B. cinerea hexose transporter gene family during … Figure S2: Impact of carbon source on the expression of members of the B. cinerea hexose … Figure S3: Changes in mRNA levels of the B. cinerea hexose transporter gene family during … Figure 40: Simplified model pathway describing the carbohydrate conversions. Figure 41: Expression of the mannitol pathway during infection and saprophytic growth. Figure 42: Proton-decoupled 13C-NMR in vivo spectra of sunflower cotyledons contaminated … Figure 43: Spectres 13C-NMR d? extraits perchloriques du mycelium de 2j de B. inerea de … Figure 44: Expression du gene de la glutamate deshydrogenase du tournesol au cours de … Figure 45: Evolution des profils des phospholipides au cours de l? infection du cotyledon de … Figure 46: Expression de genes de defense du tournesol au cours de l? infection par B. cinerea. Figure 47: Profils RMN du mycelium de 10j de M. grisea cultive sur milieu TNKYE glucose 2% … Figure 48: Expression des genes Mgmpd et Mgmtdh au cours de l? infection de l? orge par … Figure 49: Simplified model pathway describing the carbohydrate conversions. Figure 50: Steps for construction of mutants of mannitol metabolism. Figure 51: Molecular characterization of Bcmpd and Bcmtdh inactivation.

Figure 52: Alteration of BcMPD expression in Bcmtdh16 strains. Figure 53: Sugars content and mannitol genes expression during in vitro development. Figure 54: Intracellular sugars content and mannitol genes expression during response to … Figure 55: Bcmpd deletion mutant, as a tool to reveal a mannitol phosphorylation … Figure 56: Bcmpd and Bcmtdh expression during growth on synthetic media supplemented … Tables Table 1: Role des differents transporteurs d? hexoses chez S. cerevisiae. Table 2: Regulation des genes HXT1 a HXT4 de S. cerevisiae en fonction de la concentration… Table 3: Niveau normalise de metabolites dans la souche sauvage de S. odorum et les mutants… Table 4: Role definie ou suppose du trehalose, du glycerol, de l? arabitol et du mannitol chez les… Table S1 Accession numbers and list of primers for the genes used in this study. Table 5: Metabolic profiling of B. cinerea mycelium, H. annuus cotyledons, and infected… Table 6: Amorces utilisees pour les experiences de PCR quantitative. Table 7 : Quantification des metabolites detectes par spectroscopie RMN du 13C en abondance… Table 8: Accession numbers and list of primers used in this study. Table 9: Metabolic profiling of 2 days old B. cinerea mycelium grown in the presence of glucose… Table 10: Transfer rates of labelled hexoses through carbon mannitol metabolism in B. cinerea.

Pages 9 10 11 12 12 14 15 16 17 17 19 21 21 24 28 28 29 31 32 33 35 36 38 39 39 41 42 43 44 45 47 50 55 57 58 59 72 73 74 75 76 76 76 77 78 87 88 89 90 92 94 96 99 103 104 107 108 110 110 Pages 23 26 51 52 69 71 86 91 100 105 106 TABLE DES FIGURE S ET DES TABLES 5 A – EXPOSE BIBLIOGRAPHIQUE Laccaria bicolor A – EXPOSE BIBLIOGRAPHIQUE Botrytis cinerea Agaricus bisporus Ectomycorhize Ustilago maydis 6 I – INTRODUCTION Les champignons sont heterotrophes pour le carbone organique, mais peuvent utiliser l? azote, le souffre et le phosphate inorganique. Afin d? acceder a une source de carbone organique, les champignons ont adopte quatre types de comportements: saprophytes, symbiotiques, commensaux et parasites. Les champignons saprophytes se developpent sur la matiere organique morte et participent au recyclage des molecules carbonees et azotees.

Les champignons symbiotiques sont capables d? etablir une interaction cooperative avec leur hote. Ces organismes sont retrouves dans les lichens ou ils sont associes a des algues et dans les mycorhizes lors de leur association avec les racines des plantes. Les champignons peuvent aussi s? associer aux animaux, au niveau du tractus digestif, ou ils ont developpe un mode de vie commensale, se nourrissant de la matiere organique complexe que l? hote est incapable de degrader seul. Enfin les champignons parasites utilisent les etres vivants comme source nutritive. Ils sont capables d? infecter les animaux ou les vegetaux et de provoquer des maladies allant jusqu? a la mort de leur hote.

La majorite des etudes chez les champignons pathogenes des plantes sont focalisees sur les mecanismes directement lies au pouvoir infectieux. L? avenement des programmes de sequencage des genomes des champignons pathogenes a permis de developper des programmes d? etudes globales tels que les etudes transcriptomiques ou proteomiques. Le manque de connexion entre les etudes transcriptomiques et proteomiques genere des interpretations parfois erronees. En effet les donnees obtenues sur l? expression des genes ne sont pas toujours a meme de representer les evolutions reelles du proteome et encore moins du metabolome. Les etudes metabolomiques sont, d? ailleurs, assez rares en ce qui concerne les champignons pathogenes.

Il existe ainsi assez peu de donnees permettant de comprendre le metabolisme des champignons pathogenes au cours de l? infection ou du developpement in vitro. Les donnees bibliographiques presentees dans ce manuscrit ont pour but de faire le point sur l? ensemble des donnees portant sur la nutrition carbonee des champignons au cours de leur interaction avec les plantes. L? interaction entre les plantes et les champignons mycorhiziens et pathogenes sera largement presentee dans l? introduction bibliographique. Cette introduction traitera (i) du developpement des structures fongiques permettant l? interaction avec la plante; (ii) des transporteurs d? hexoses fongiques, qui permettent aux champignons de s? pproprier les ressources en sucre de la plante; (iii) de la conversion des sucres de la plante en polyols et trehalose par le partenaire fongique et du role de ces composes dans la physiologie des champignons. Enfin (iv) l? impact de l? interaction plantes/champignons pathogenes sur la physiologie des plantes sera presente. Les travaux de these presentes dans ce manuscrit ont pour objectif de comprendre comment le champignon pathogene necrotrophe, Botrytis cinerea, se nourrit lors de son interaction avec le tournesol. Les resultats indiquant que le mannitol est un compose majeur de B. cinerea que ce soit lors de l? infection ou au cours de la croissance du champignon en condition in vitro.

Des etudes de genomique inverse, de biochimie et de physiologie ont ete entreprises pour comprendre le role du 7 mannitol chez ce champignon. L? analyse des mutants des deux voies de biosynthese du mannitol nous a egalement permis de proposer un role pour chacune de ces voies. D? autres resultats, obtenus avec le pathogene hemibiotrophe Magnaporthe grisea au cours de son interaction avec l? orge seront egalement presentes dans ce manuscrit. 8 II – MODES TROPHIQUES DES CHAMPIGNONS EN INTERACTION AVEC LES PLANTES II. 1 – La symbiose mycorhizienne Les sols sont en general riches en composes organiques complexes tels que la cellulose et la lignine.

Ces composes, dont la degradation est lente, sont essentiellement accessibles a des microorganismes specialises. Les composes facilement utilisables comme les sucres sont assez peu representes dans le sol si ce n? est au niveau des racines des plantes qui secretent des exsudats. Les plantes etant autotrophes pour le carbone, elles n? ont pas besoin de rechercher des carbohydrates dans le sol. Cependant elles restent heterotrophes pour l? azote, le soufre ou encore le phosphore et doivent puiser dans le sol des composes leur procurant ces nutriments essentiels. Les plantes peuvent utiliser les formes minerales telles que le phosphate inorganique ou l? mmonium (NH 4+) mais ceux-ci ne sont pas toujours en concentration suffisante dans les sols pour permettre la croissance des plantes, ou peuvent etre difficilement accessibles car pieges dans les argiles ou autres constituants des sols. De nombreuses communautes microbiennes vivent au niveau des racines des plantes. Des associations de type symbiotique existent entre micro-organismes et racines et donnent naissance a des structures specialisees. C? est le cas des nodules ou encore des mycorhizes qui permettent la symbiose entre les racines des plantes et respectivement des bacteries du genre Rhizobium ou des champignons. Ces associations sont basees sur des changes reciproques entre les organismes et assurent la perennite des symbiontes. Dans le cas des mycorhizes, la plante fournit des sucres au champignon et recoit en retour, de l? ammonium, de l? eau, des acides amines ou encore des mineraux (Figure 1, Nehls, 2008). Les champignons etant capables de s? etendre sur de grandes distances dans les sols, ils sont capables de prospecter d? importants volumes de sol et permettent d? augmenter les tres largement la surface d? absorption de la plante. Globalement plantes mycorhizees croissent mieux et resistent mieux a la secheresse que les plantes Figure 1: Echanges entre une plante et un type de mycorhize (l? ctomycorhize). Adapte de Nehls, 2008 non mycorhizees (Sheng et al. 2008; Aroca et al. , 2008). De plus la presence de mycelium au niveau des racines protegerait celles-ci des attaques des organismes pathogenes (Huang et al. , 2003; Pozo et AzconAquillar, 2007). Les deux principaux types de mycorhizes sont les ecto- et les endomycorhizes. Les champignons ectomycorhiziens se caracterisent par la formation d? un manteau fongique autour des 9 racines et sont capables, pour un certain nombre, de developper des carpophores (aussi connus sous le nom chapeaux) alors que les champignons endomycorhiziens ne forment ni de manchon fongique ni de chapeau.

Les champignons ectomycorhiziens (ex: truffes, laccaires, amanites, chanterelles) sont capables de vivre dans le sol sans etre associes a une plante alors que les endomycorhiziens (ex: famille des Glomus) sont des symbiontes obligatoires, ce qui rend leur etude plus difficile. Les arbres qui dependent des ectomycorhizes ne representent pas plus de 3% des taxa vegetaux (pin, sapin, bouleau…), mais constituent cependant les essences dominantes des forets des regions boreales, temperees et montagneuses. Les champignons endomycorhiziens concernent pres de 80% des especes vegetales. Les symbioses entre champignons ecto- et endomycorhiziens se differencient par la relation plus ou moins etroite qu? entretient le champignon avec les cellules vegetales. Chez les champignons ectomycorhiziens, le mycelium penetre la racine et forme au niveau des cellules du cortex racinaire un reseau d? yphes appele le reseau intercellulaire de Hartig (Figure 2). Le champignon ne penetre jamais les cellules vegetales. Les echanges de nutriments ont lieu au niveau A B Figure 2: Structures ectomycorhiziennes. A – Schema d? une racine de pin colonisee par un champignon ectomycorhizien. B – Ectomycorhize entre Pinus radiata et amanita muscaria, manchon forme suite a la colonisation d? une racine de Pinus radiata par Pisolitus tinctorius et reseau de Hartig (fleche) de Picea glauca colonise par un champignon ectomycorhizien. Adapte de http://mycorrhizas. info/ecm. html de ce reseau. Les hyphes extra-racinaires permettent l? absorption des nutriments presents dans le sol.

La disponibilite tres recente du premier genome d? un champignon mycorhizien, Laccaria bicolor (Martin et al. , 2008) a permis mieux comprendre le fonctionnement de ces champignons. Par exemple sur 446 proteines impliquees dans l? interaction hote/pathogene (recensees dans la base PHI-base v 2. 2, http://www. phi-base. org/), 351 sont presentes dans le genome de L. bicolor. Cela inclut aussi bien des genes de pathogenicite que de virulence impliques dans l? interaction des champignons avec des plantes ou des animaux. La frontiere entre champignons pathogenes et symbiotiques est sans doute plus etroite que ce qui avait ete imagine jusqu? alors. De plus des etudes d? immunolocalisation 10 d? ne petite proteine secretee, MISSP7, indiquent que cette proteine est fortement accumulee dans le reseau de Hartig et pourrait participer au dialogue entre le champignon et son hote (Martin et al. , 2008). Chez les champignons endomycorhiziens, les propagules (spores ou mycelium presents au niveau de racines vivantes ou mortes) (Requena et al. , 1996) peuvent croitre dans le sol en utilisant leur reserve pendant une a deux semaines. Si le champignon ne rencontre pas de racines a coloniser la croissance s? arrete et un phenomene d? autolyse s? enclenche, permettant la formation de nouvelles propagules qui resteront en dormance dans le sol. Dans le cas ou le champignon entre en contact avec des racines, il differencie un appressorium (structure de penetration), lui permettant d? entrer dans la racine. L? ppressorium est la premiere structure que le champignon produit lorsqu? il est au contact de la plante et sa formation serait dependante de l? age de la racine (Tawaraya et al. , 2007), les regions jeunes des racines etant plus facilement colonisees que les regions agees. L? hyphe penetrant la surface de la racine se developpera par la suite entre et dans les cellules de l? exoderme et du cortex de la racine. Le champignon forme des arbuscules dans les cellules vegetales. Ces structures, formees d? hyphes ramifies, ne penetrent pas la membrane plasmique des cellules Figure 3: Structures endomycorhiziennes. A – Schema representant les hyphes exta-racinaires d? n champignon endomycorhizien ayant colonise une racine. B – Schema et vues representant les differentes structures fongiques permettant au champignon endomycorhizien d? etablir son interaction avec la plante. C – Appressoria (fleches jaunes) et hyphes developpes par Glomus versiforme lors de l? interaction avec les racines du poireau (Allium porrum). Arbuscule mature de Glomus mosseae. Vesicules d? une espece du genre Acaulospora en interaction avec les racines du trefle. Adapte de http://mycorrhizas. info/vam. html vegetales mais l? invaginent ce qui permet d? augmenter la surface de contact et donc d? echange (Figure 3). Cette structure peut d? ne certaine maniere rappeler l? haustorium des champignons parasites biotrophes (voir le paragraphe II. 2). La colonisation de la racine est accompagnee du developpement de vesicules servant d? organes de reserve (van Aarle et Olsson, 2003) ainsi que d? hyphes extra-racinaires, permettant au champignon d? acceder aux nutriments presents dans le sol. 11 II. 2 – Les champignons biotrophes Les champignons phytopathogenes biotrophes sont responsables de maladies telles que l? oidium (powdery mildew), le mildiou (downey mildew) ou la rouille (rust). (Voegele, 2006). Un exemple des symptomes engendres par ce type de pathogene est presente dans la figure 4.

Les champignons biotrophes ont la particularite de ne pouvoir completer leur cycle de developpement que sur leur hote et de ne pouvoir se A B developper que sur des tissus vivants. Ce sont par consequent des parasites obligatoires qui ne peuvent pas etre cultives in vitro. Contrairement pathogenes aux fongiques, biotrophes par (ii) (i) des une une autres les sont forte activite C Figure 4: Symptomes foliaires observes lors de l? infection par differents champignons biotrophes. A, Oidium (Podosphaera leucotricha) sur feuilles de pommier; B, Mildiou (phytophthora infestans) sur feuilles de pomme de terre; C, Rouille (Uromyces fabae) sur feuilles de feve. champignons caracterises differenciation d? infection, structures ecretrice limitee, (iii) un contact etroit avec les cellules de l? hote, (iv) une suppression des defenses de la plante sur le long terme et (v) la formation d? haustoria (Mendgen et Hahn, 2002). De plus, l? infection d? une plante par les champignons biotrophes active specifiquement la voie de defenses dependantes de l? acide salicylique. Les necrotrophes, detailles dans le chapitre suivant, activent d? autres voies de signalisation de defense, dependantes de l? ethylene et de l? acide jasmonique (Glazebrook, 2005). Le cycle de developpement des champignons biotrophes est tres complexe et peut impliquer l? infection sequentielle de plusieurs hotes. Certains champignons comme Uromyces abae (rouille) sont capables de produire 5 types de spores (basidiospores, teliospores, pycniospores, aeciospores et uredospores) sur le meme hote. Seules les basidio-, aecio- et les uredospores sont capables d? infecter la plante. Dans le cas des uredospores (Figure 5), une fois fixees au niveau de la surface vegetale, les spores germent et developpent un appressorium (Kapooria, 1971). Cette structure specialisee permet Figure 5: Etapes de l? infection par Uromyces fabae (forme dicaryon). L? uredospore (S) attachee a l? hote par un pied d? adhesion (P) emet un tube germinatif (GT) qui differencie un appressorium (A) au dessus du pore stomatique. L? hyphe de penetration (PE) penetre la chambre substomatique et se differencie en hyphe d? nfection (IH) qui formera les cellules meres haustoriales (HM) a l? origine des haustoria (H) qui envahissent les cellules hotes. Les haustoria s? entourent d? une matrice extra-haustoriale (EHM, en jaune) Adapte de Mendgen et Hahn, 2002 12 au champignon de penetrer la plante, l? appressorium differenciant un hyphe de penetration qui permettra l? entree au niveau des stomates de la plante (Mengden et Hahn, 2002). La penetration des feuilles par les stomates necessite pour le champignon d? etre capable de sentir la topographie de la feuille et de reconnaitre les cellules de garde du stomate et de les franchir (Allen et al. , 1991; Staples and Hoch, 1997).

La reconnaissance des stomates et de leur position serait non seulement dependante du sensing de surface mais aussi de la perception de molecules chimiques comme des alcools (cis-3-hexen-1-ol, trans-2-hexen-1-ol…), et des canaux calcium seraient aussi impliques (Collins et Thomas, 2001). Chez les champignons biotrophes responsables du mildiou (Perfect et Green, 2002), l? appressorium est capable de traverser la barriere que represente la cuticule via l? utilisation d? enzymes hydrolytiques associes a une force mecanique developpee par l? appressorium. L? appressorium se presente sous la forme d? un dome melanise, separe du tube germinatif par un septum. L? appressorium d?

Uromyces appendiculatus est capable de developper une pression de 0,35 MPa (Terhune et al. , 1993). Quelle que soit la strategie d? invasion, le champignon, une fois en contact avec les cellules vegetales, differencie un haustorium. Autour de l? haustorium, le champignon developpe une matrice dite extrahaustauriale qui separe le pathogene de la membrane plasmique de l? hote. Cette matrice permettrait au champignon de se proteger des defenses de la plante, en evitant le contact direct des membranes plasmiques (Kemen et al. , 2005). L? haustorium assure le dialogue entre le champignon et la plante aussi bien au niveau metabolique (Voegele et al. , 2001, 2004, 2006) qu? u niveau signalisation via la secretion de proteines probablement impliquees dans la reprogrammation des cellules vegetales comme suspecte chez Ustilago maydis, pathogene du mais (production de tumeur) (Mueller et al. , 2008). L? analyse de genes induits par U. fabae au cours de l? infection a permis de mettre en evidence le gene Ufrtp1. La proteine codee par ce gene est non seulement localisee (par immunofluorescence et microscopie electronique) au niveau de la matrice extrahaustauriale, mais aussi dans les cellules infectees, ce qui suggere un role de cette proteine dans le maintien de la biotrophie (Kemen et al. , 2005). Les cellules parasitees par les champignons responsables de l? oidium sont maintenues en vie, alors que les zones eloignees du site d? infection commencent a mourir (symptome de chlorose), c? est ce que l? n appelle «effet ilot vert» (green island effect). Cela suppose une suppression partielle des defenses systemiques de la plante au site de l? infection et une redefinition de la zone infectee en tissus puits [les feuilles etant des tissus sources et les racines par exemple des tissus puits, c? est-a-dire consommant des photoassimilats (composes derivant de la photosynthese)] (Fotopoulos et al.. , 2003). En fin d? infection, le parasite produit des spores lui permettant de se disseminer dans l? environnement. 13 II. 3 – Les champignons necrotrophes: modele d’etude Botrytis cinerea Les champignons necrotrophes tels que Botrytis cinerea, Sclerotinia sclerotiorum ou encore

Stagonospora nodorum presentent une strategie d? infection diametralement opposee a celle des champignons biotrophes. En effet ces champignons ne peuvent pas se developper sur des tissus vivants et ont developpe un arsenal complexe leur permettant de tuer les cellules vegetales pour ensuite s? en nourrir en saprophytes. Dans cette partie, seul B. cinerea sera presente. Il est a l? heure actuelle le modele de champignon necrotrophe le mieux caracterise et il est l? objet des travaux presentes dans ce rapport. B. cinerea represente la forme anamorphe haploide asexuee alors que B. fuckeliana est la forme teleomorphe diploide sexuee. Seule la forme anamorphe est retrouvee dans la nature.

Les donnes presentees ci-dessous ne traiteront que de la forme anamorphe. II. 3. 1 Cycle infectieux et conditions d? infection Le especes genre Botrytis regroupe 22 especes, fabae, calthae) qui infecte B. cinerea forme un petit groupe distinct avec 3 autres (pelargonii, specifiquement les plantes dicotyledones (Staats et. al. 2005). B. cinerea, est capable d? infecter plus de 230 especes vegetales a interet agronomique aussi bien au niveau des feuilles (haricot vert, tournesol, vigne…), des petales (roses, gerbera…), des fruits (fraise, vigne…), des organes (Jarvis, de reserve L? infection (carotte, de ces cotyledons…) 1977). Figure 6: Impacts de B. inerea sur les differents organes des vegetaux. Symptomes observes au cours de l? infection par B. cinerea de fruits (a), fraise ; b), framboise et de fleurs (c) rose). Adapte de Williamson et al. , 2007 vegetaux peut avoir lieu en champs, en serre, mais aussi lors de leur stockage, meme a faible temperature (Droby et Lichter, 2004). L? infection des vegetaux par B. cinerea engendre des symptomes assez differents en fonction des organes ou des tissus attaques (figure 6). Les necroses formees par le pathogene ramollissent les tissus mous (degradation de la paroi vegetale) et sont gorges d? eau, d? ou le nom donne a B. cinerea de pourriture molle. En fin d? nfection, les necroses deviennent sporulantes et permettent la dissemination du pathogene (principalement aerienne). Les necroses sporulantes prenant une coloration grisatre, ce parasite est aussi appele agent de la pourriture grise. B. cinerea possede egalement une forme de resistance, formee dans les tissus envahis, qui se presente sous la forme de sclerotes melanises formes par l? amoncellement d? hyphes dans une matrice polysaccharidique amorphe. La melanine et la paroi de ? -glucane encapsulant les sclerotes leur permettent de resister a la dessiccation, aux rayonnements UV et aux attaques de micro-organismes sur de longues periodes (Backhouse and Willets, 1984).

Les sclerotes amorcent leur developpement au printemps (dans les regions temperees) et produisent des conidiophores et des conidies afin de disseminer le parasite (Figure 7). Le mycelium de B. cinerea est aussi capable de survivre dans les 14 tissus morts de l? hote ou dans certaines graines qui serviront d? inoculum primaire. L? infection debute avec la fixation des conidies a la surface de l? hote. Les conidies germent, developpent un tube germinatif qui forme un pseudo-appressorium (Figure 7)(Tenberge, 2004). L? appressorium de B. cinerea est different de ceux des champignons biotrophes (voir II-2) ou hemibiotrophes (voir II-4), puisqu? il se presente sous la forme d? un petit renflement, non cloisonne, de l? yphe primaire et que pour franchir la cutine des plantes il ne developpe pas de pression de turgescence (Doss et. al, 2003) mais secrete des enzymes hydrolytiques. B. cinerea est egalement capable d? infecter des tissus sains depuis une zone infectee via la formation de structures specialisees appelees coussins d? infection (Backhouse, 1987; Jarvis, 1980). Les coussins d? infection peuvent par exemple etre formes lorsqu? une feuille infectee entre en contact avec une feuille saine. Ce mecanisme d? infection est utilise en laboratoire lors des essais d? infection avec des implants myceliens (fragment de gelose sur lequel s? est developpe le champignon). Bien que B. cinerea soit capable d? nfecter des tissus sains, il est souvent decrit comme un champignon profitant des blessures des plantes pour penetrer et envahir les tissus vegetaux (Staples et Mayer, 1995; Edlich, 1989). Les insectes seraient aussi a l? origine de la dissemination de B. cinerea et pourraient permettre l? entree du pathogene dans les tissus vegetaux (Woodford et al, 2002). L? humidite relative est importante pour toutes les etapes de l? infection et une humidite relative de 93% est necessaire dans le cas de la germination des conidies et de l? infection de petales de rose en absence de gouttelettes d? eau (Williamson et al. , 1995). Le pathogene acheve son cycle infection par la production de conidies (Prins et al. 2000). Figure 7: Cycle de developpement de B. cinerea. Le developpement de B. cinerea est initie par la germination de spores asexuees (macro-conidies) a la surface de l? hote suivie de la penetration, de l? envahissement et de la destruction des tissus de l? hote a lauqelle fait suite la production de macroconidies. Les conidies sont dispersees par le vent et la pluie. En hivers, B. cinerea produit des sclerotes (des fragments de mycelium peuvent egalement etre heberges sous les ecorces). Au printemps ces structures germent pour former du mycelium qui produira des conidiophores et dispersera a nouveau le pathogene. Bien que le cycle sexue de B. inerea soit possible en laboratoire, ce cycle est tres rare dans la nature. Le cycle sexue necessite la rencontre de deux thalles de poles sexuels opposes. Adapte de Fillinger et al. , 2008 (3rd Botrytis Workshop) 15 II. 3. 2 Une strategie d? attaque basee sur un arsenal enzymatique et la secretion de toxines B. cinerea est un champignon polyphage, ce qui necessite un arsenal enzymatique varie pour degrader des tissus contenant des polymeres et des nutriments tres diversifies. De nombreuses etudes ont ete menees pour comprendre les mecanismes mis en place par B. cinerea pour degrader les tissus vegetaux et ont permis de mettre en evidence qu? un certain nombre d? entre eux sont essentiels au processus infectieux.

La cutine recouvre les organes aeriens des plantes et forme une barriere que les champignons doivent franchir pour envahir les tissus vegetaux sousFigure 8: Structure de la paroi vegetale. jacents. L? utilisation d? anticorps anti-cutinases et anti-lipases a permis de mettre en evidence que ces activites enzymatiques etaient necessaires pour la penetration de petales de gerbera (van Kan et al. , 1997) ou de feuilles de tomate (Commenil et al. , 1998). Les genes BccutA, codant une cutinase exprimee au cours de la penetration (van Kan, 1997), et Bclip1, codant une lipase induite au cours des etapes precoces de l? infection (Commenil et al. , 1995, 1999) ont ete mutes, et bien que les activites correspondantes soient negligeables dans les mutants ? BccutA et ?

Bclip1, aucun ne presente de diminution du pouvoir infectieux. Recemment un double mutant ? BccutA ? Bclip1 a ete construit et n? est en rien affecte dans sa capacite a infecter les feuilles de haricot ou les petales d?? illet (Reis et al. , 2005). Cependant la presence de nombreux genes codant des cutinases et des lipases dans le genome de B. cinerea (Williamson, 2007) peut expliquer ce resultat. Une fois passee la barriere que represente la cutine, le pathogene entre en contact avec la paroi des cellules vegetales riche en pectine, cellulose et hemicellulose (Figure 8). La secretion de pectinases comme les endopolygalacturonases (endoPG) permet aux champignons de degrader la pectine. B. inerea possede 6 endoPG, notees BcPG1-6, dont l? expression depend de l? hote, des tissus et des conditions d? infection utilisees (Wubben et al. , 1999; ten Have et al. 2001). Les simples mutants ? Bcpg1 et 2 presentent un pouvoir pathogene altere; le mutant Bcpg1 est affecte dans la formation des lesions secondaires (les lesions secondaires succedent aux lesions primaires apres une phase de latence) (ten Have et al. 1998) et le mutant ? Bcpg2 est altere dans les stades primaires de l? infection (Kars et al. 2005). En ce qui concerne les autres polygalacturonases, les simples mutants ? Bcpg3-6 ne semblent pas etre alteres dans leur processus infectieux.

Poinssot et al. (2003) ont montre que BcPG1, en plus d? etre un facteur de virulence, etait aussi un facteur d? avirulence, c? est-a-dire pouvant etre reconnu par la plante et induire les mecanismes de defense de cette derniere. Chez la vigne, la proteine purifiee BcPG1 entraine un influx de calcium, la production transitoire d? H2O2, l? activation d? une voie MAPK et l? induction de nombreux genes de defense des plantes (lipoxygenase, phenylalanine ammonia lyase…). L? incubation de BcPG1 durant 1h a 45°C reduit l? activite de l? enzyme de plus de 90%, mais n? abolit pas l? activite elicitrice de cette derniere alors que la denaturation de l? nzyme a 100°C ou la reduction des ponts disulfures abolit aussi bien l? activite elicitrice que l? activite enzymatique de BcPG1. L? activite elicitrice de BcPG1, n? est donc pas dependante 16 de l? activite enzymatique. La vigne est ainsi capable d? identifier un motif proteique et d? activer une voie de signalisation en reponse a cette reconnaissance. La pectine methylee (presente dans les feuilles, pratiquement absente dans les fruits) ne peut pas constituer un substrat pour les endopolygalacturonases. B. cinerea possede au moins 2 genes codant des pectine methylesterases (PME) (Reignault P. et al. , 1994). Cependant, l? analyse des mutants ? Bcpme1, ?

Bcpme2 ou du double mutant indique que les enzymes BcPME1 et 2 ne sont pas necessaires pour l? infection et pour la Figure 10: Test de pathogenie sur feuille de haricot des souches sauvages de B. cinerea souches T4, SAS 56 et ATCC 58025 et de mutants de la voie de biosynthese du botrydial. Figure 9: Le botrydial. Adapte de Siewers et al. , 2005 degradation de la pectine methylee in vitro (Kars et al. , 2005). L? un des resultats les plus recent concernant les enzymes de degradation de la paroi a ete obtenu lors de l? analyse du gene Bcxyn11A codant une endo-? -1,4-xylanase, impliquee dans la degradation de l? hemicellulose. Le mutant correspondant est fortement affecte dans sa pathogenese, et presente un retard dans l? pparition des lesions secondaires (lesions suivant la phase de latence post-penetration) et une reduction de plus de 70% de leur taille. Si l? action des enzymes de degradation des parois cellulaires vegetales de B. cinerea semble importante pour le processus infectieux, il semble que le role de la plante ne soit pas a negliger. Une etude tres recente sur la tomate a permis de mettre en evidence que le fonctionnement du systeme de modification de la paroi (polygalacturonase et extensine) au cours de la maturation de la tomate etait indispensable pour que B. cinerea infecte la tomate fruit (Cantu et al. , 2008). Outre les enzymes de degradation, B. cinerea est egalement capable de secreter un grand nombre de toxines (Collado et al. 2000, 2007) dont les plus etudiees sont le botrydial (Figure 9), les especes activees de l? oxygene et l? acide oxalique. Le botrydial est secrete par Botrytis en culture in vitro et au cours de l? infection (Deighton et al. , 2001). Ce compose induit la chlorose des feuilles, la mort des cellules et faciliterait ainsi la penetration et la colonisation des tissus (Colmenares et al. , 2002). Les genes permettant la synthese du botrydial sont organises en cluster. L? expression des genes de ce cluster est coordonnee et fortement induite au cours de l? infection (Siewers et al. , 2005; Gioti et al. , 2006). La deletion du gene Bcbot1 codant une des enzymes de la voie de biosynthese du botrydial dans 3 souches de B. inerea (T4, SAS56 et ATCC 58025) indique que le botrydial est un facteur de virulence souche dependante. Seul le mutant ? Bcbot1 de la souche T4 est fortement affecte dans sa virulence (Figure 10). Les souches SAS56 et ATCC 58025 sont sans doute capables de compenser l? absence de botrydial en produisant d? autres toxines comme l? acide botcinique ou l? acide abscissique par exemple (Choquer et al. , 2007). 17 Au cours de l? infection, la plante declenche la reponse hypersensible (HR), ce qui a pour effet de provoquer la mort cellulaire programmee et la production d? especes reactives de l? oxygene (ROS) (Pontier et al. , 1998). B. cinerea possede de nombreuses enzymes lui permettant de se proteger contre les ROS (Gil-ad et al. , 2000).

Il secrete par exemple des enzymes aux activites catalase, superoxyde dismutase et peroxydase pour detoxifier le peroxyde d? hydrogene H 2O2 (Gil-ad et al. , 2000). Des etudes ont permis de montrer que la mort cellulaire programmee ainsi que la production de ROS par les cellules vegetales est necessaire a l? invasion des tissus par B. cinerea (Govrin et Levine 2000). En parallele, B. cinerea produit lui aussi des ROS (Schouten et al. , 2002; Tenberge, 2004) comme du peroxyde d? hydrogene et des ions OH. radicalaires. L? agressivite des souches de B. cinerea serait en partie liee a la production de ces composes (Schouten et al. , 2002; Tiedemann, 1997). En dehors du botrydial ou des ROS, B. inerea est connu pour produire de l? acide oxalique in vitro (Germeier et al. , 1994) et in planta (Verhoeff et al. 1988). L? acide oxalique est un agent phytotoxique qui joue le role de cofacteur de la pathogenese. La fonction de ce compose est d? abaisser le pH ambiant afin de favorise l? activite des enzymes de degradation dont le pH optimum d? activite bas (Manteau et al. , 2003). L? acide oxalique stimule la degradation de la pectine par les PG en sequestrant les ions Ca 2+, ce qui a pour effet de destabiliser les interactions moleculaires entre les differents polymeres de la paroi vegetale (Rio et al. , 2008). Les composes phytotoxiques tels que l? cide oxalique, les ROS ou encore le botrydial seraient egalement impliques dans la mort cellulaire programmee chez l? hote. Kim et al. (2008) ont mis en evidence recemment que l? acide oxalique induisait les voies de signalisation aboutissant a la mort cellulaire programmee. L? acide oxalique aurait pour effet d? augmenter le niveau de ROS chez les plantes, ce qui provoquerait l? induction de la mort cellulaire programmee. Ce resultat montre a quel point la relation plantes/champignons necrotrophes est subtile et surtout que ces champignons sont capables, comme les champignons biotrophes et hemibiotrophes, de controler les reactions de defense de la plante hote et de les detourner a leur profit. Il est donc possible que d? utres toxines ou meme des proteines produites par B. cinerea manipulent les mecanismes de signalisation de la plante pour permettre l? induction de la mort cellulaire programmee. II. 4 – Les champignons hemibiotrophes La strategie d? infection developpee par les champignons hemibiotrophes releve a la fois du comportement biotrophe et necrotrophe. Les hemibiotrophes ont, dans un premier temps, un comportement biotrophe, c? est-a-dire qu? ils vivent dans les tissus de l? hote sans detruire les cellules vegetales, mais ne forment generalement pas d? haustoria et developpent de ce fait une relation moins etroite avec leur hote que les biotrophes.

Apres la phase biotrophe, le parasite hemibiotrophe va enclencher, pour des raisons encore inconnues, une phase necrotrophe et degrader les tissus de l? hote. Les champignons hemibiotrophes les plus etudies sont M. grisea et les champignons du genre Colletotrichum. M. grisea a un spectre d? hote extremement etroit et est connu comme le pathogene le plus important du riz, responsable en 2000 de la perte d? environ 25% de la production de riz du Japon 18 (Ribot C. , 2008). Les especes de Colletotrichum sont responsables de l? infection d? un grand nombre de plantes agricoles et ornementales (Bailey et Jager, 1992). Les cycles de developpement de M. grisea et des champignons du genre Colletotrichum ont des points communs. Les spores du athogene, une fois fixees a la surface du vegetale, germent et produisent un tube germinatif qui differencie un appressorium (Mendgen et Hahn, 2002, Figure 11). La germination et la differenciation appressoriale sont associees, chez C. gloesporioides (infectant l? avocat) et C. musea (infectant la banane) a la perception a la fois de la surface vegetale et de molecules chimiques comme l? ethylene et les cires presentes a la surface de l? hote (Podila et al. 1993, Hwang 1 2 et al. 1995). L? ethylene est une hormone liberee par les fruits lors de leur maturation. La capacite des spores a en initier leur au les Les par germination presence Figure 11: Etapes d? infection chez les champignons hemibiotrophes. 1 – La spore de C. indemuthianum (S) se fixe a l? hote et emet un tube germinatif qui differencie un appressorium melanise (A). La pression de l? appressorium permet a l? hyphe de penetration (PE) de traverser la cuticule de l? hote ainsi que la paroi vegetale. Cette derniere se differencie en une vesicule (V) qui developpe des hyphes primaires (PH). Les hyphes primaires sont en contact etroit avec la membrane plasmique des cellules vegetales et sont separes de celles-ci par une matrice extracellulaire. Les cellules vegetales restent vivantes durant la phase biotrophe (a) et une matrice separe les deux organismes (en jaune). Un ou deux jours apres la penetration, la membrane plasmique de l? ote est degradee declenchant la mort cellulaire des cellules vegetales (b) Lorsque de nouvelles cellules hotes sont colonisees par les hyphes primaires, la phase transitoire de biotrophie suivie de la destruction des cellules de l? hote est repetee (c). Cette interaction se poursuit jusqu? au developpement d? hyphes secondaires (SH) qui degradent les parois vegetales en secretant des enzymes lytiques (fleches). Adapte de Mendgen et Hahn, 2002 2 – Spore de M. grisea developpant un appressorium. d? ethylene pathogene leur permet d? attaquer fruits a un moment precis de developpement. formes appressoriums M. grisea et C. species sont similaires a ceux de certains biotrophes, c? st-a-dire qu? ils se presentent sous la forme d? un pression dome une interne, melanise forte jusqu? a concentrant 8 MPa chez M. grisea. Cette structure hautement differenciee a ete, et est toujours tres etudiee. Des mutants de M. grisea deficients dans la synthese de la melanine sont non pathogenes car ils sont bloques a l? etape de penetration de la cutine (Valent B. et Chumley FG. , 1991). Ce phenotype serait du au fait que la melanine forme une couche impermeable qui previent la fuite des molecules permettant la montee en pression dans l? appressorium (Howard et al. , 1991). L? un des osmolytes responsable de la pression de turgescence de l? ppressorium est le glycerol. Ce dernier est tres fortement concentre dans cette cellule. Sa concentration atteindrait 3,2 M (de Jong et al. , 1997). Cependant la pression de turgescence ne serait pas suffisante et M. grisea ou C. species utiliseraient des cutinases pour franchir la cutine des plantes (Dean et al. , 2005, Pascholati et al. , 1993; Dickman et al. , 1982). Une fois entres dans la plante, les champignons hemibiotrophes developpent des hyphes specialises differents selon que le champignon soit en phase biotrophe ou necrotrophe. Par exemple, certaines especes de Colletotrichum sont dites de type subcuticulaires intraparietales (Sarah E. Perfect et al. 1999) car leurs hyphes se developpent, lors de la phase biotrophe, entre la paroi des cellules 19 vegetales et la membrane plasmique. Bien que ces hyphes soient au contact des membranes vegetales, elles ne sont pas aussi specialisees que les haustoria des champignons biotrophes (O? Connell, 1987; Green et al. , 1995). Cependant ces hyphes intracellulaires primaires partagent un point commun avec les haustoria, la presence d? une matrice separant le champignon de la plante hote (O? Connell, 1987; Green et al. , 1995). Cette matrice pourrait avoir un impact important dans l? etablissement et le maintien de la biotrophie et pourrait avoir un role dans la suppression des defenses de la plante.

Une glycoproteine (CIH1) specifiquement exprimee au niveau des hyphes intracellulaires de C. lindemuthianum, au cours de l? infection du haricot, a ete decouverte (Perfect et al. , 1998). Elle possede des caracteristiques propres aux proteines de la paroi des cellules vegetales (glycosylation, domaine riche en proline) et pourrait permettre a la paroi ou a la matrice presente entre le champignon et les cellules vegetales de mimer la paroi de ces dernieres. De meme, le champignon est capable de masquer sa paroi a la plante en deacetylant sa chitine en chitosan (El Gueddari et al. , 2002). Lorsque les conditions environnementales le permettent, les champignons hemibiotrophes passent de la biotrophie a la necrotrophie.

Au cours de cette derniere phase les champignons du genre Colletotrichum forment des hyphes secondaires, de diametre inferieur aux hyphes intracellulaires primaires et secretent des enzymes de degradation comme les PG, les pectinelyases ou les proteases qui degradent la paroi vegetale (Munch et al. , 2007, Herbert et al, 2004, Wijesundera et al. , 1989). Le cycle de developpement s? acheve avec la sporulation du pathogene. III – ASSIMILATION DES HEXOSES PAR LES CHAMPIGNONS Les hexoses et en particulier le glucose (glucide le plus abondant sur Terre) representent la source carbonee la plus frequemment utilisee par les etres vivants. De ce fait, les cellules ont developpe des systemes d? influx plus ou moins complexes en fonction de ou des environnements dans lesquels elles vivent.

Cortassa et Aon, 1993 et Oehlen et al. , 1994 ont montre que la premiere etape du metabolisme des sucres est la plus limitante et correspond au transport a travers la membrane plasmique. Les transporteurs de sucres ont ete bien decrits chez la levure comme Saccharomyces cerevisiae et chez les champignons biotrophes et mycorhiziens. Les deux premieres parties de ce chapitre aborderont la problematique du transport des hexoses chez ces differents organismes. Dans le cas des champignons vivant en interaction avec les plantes, le glucose n? est generalement pas la source carbonee majoritaire, mais le saccharose (une molecule de glucose liee a une molecule de fructose) l? est.

Les champignons en fonction de leur type trophique ont developpe differentes strategies pour acceder a ce nutriment. La derniere partie de ce chapitre abordera la question de la degradation du saccharose lors de l? interaction plante/champignon. 20 III. 1 – Les transporteurs d’hexoses chez Saccharomyces cerevisiae III. 1. 1 Generalite sur les transporteurs de sucres Les transporteurs de sucres appartiennent a la superfamille MFS (Major Facilitator Superfamilly, Figure 12). Plus de 2000 sequences proteiques, appartenant aussi bien a des bacteries qu? a des eucaryotes, ont ete identifiees comme appartenant aux transporteurs de type MFS (Chang et al. , 2004).

Les transporteurs de cette superfamille possedent generalement 12 traversees membranaires bien que certains en contiennent 14 et que recemment Wood et al. , 2002 aient mis en evidence chez la bacterie Paracoccus pantotrophus une proteine de type MFS contenant 24 traversees membranaires. Les transporteurs de type MFS comprennent aussi bien des uniporteurs, des symporteurs que des antiporteurs et se subdivisent en 17 familles de transporteurs (Pao et al. , 1998). Figure 12: Representation tridimensionnelle de la proteine GlpT de Escherichia coli de type MFS. Adapte de Lemieux, 2008 Les transporteurs de sucres, regroupes dans la famille SP (Sugar Porter) (Pao et al. 1998), sont soit des uniporteurs soit des symporteurs a H+; ils sont constitues de 12 traversees membranaires (TM) hydrophobes (Pao et al. , 1998), contiennent deux motifs specifiques des proteines du type MFS: GRR et RG ainsi que les motifs QxxG dans la TM7, RR entre les traversees 8 et 9 et le motif F dans la TM10 Figure 13: Topologie predite et motifs conserves de differents transporteurs d? hexoses fongiques. Les residus conserves des transporteurs de monosaccharides de S. sclerotiorium (Ss), U. fabae (Uf), Trichoderma harzianum (Th), A. muscaria (Am), Aspergillus parasiticus (Ap) et B. cinerea (Bc) sont indiques dans les encadres gris.

Leurs positions sont indiques par les fleches et les traversees membranaires sont indiquees par les rectangles noirs. La taille ainsi que la position des motifs conserves du transporteur SsHXT1 sont presentees a titre indicatif. Adapte de Jobic et al. , 2007 (Jobic et al. , 2007) (Figure 13). Les regions N et C-terminales sont situees dans le cytoplasme des cellules. Les TM 6 et 7 sont separees par une region hydrophile, de longueur