stage chromatographie

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stage MAFPEN CHROMATOGRAPHIE 26 et 28 Janvier 1998 Edith ANTONOT Rob 0 p g Lycée Louis Vincent – Chromatographie: théorie Bibliographie: ### « Chimie organique expérimentale » Auteurs: Chavanne, Beaudoin, Jullien, Flamand . Editeur: Belin « Analyse chimique (méthodes et techniques instrumentales modernes) » Auteur: Rouessac . Editeur: Masson ### « 144 manipulations de chimie générale et minérale » Auteur: Defranceschi. Editeur : Ellipses cours de chromatographie en phase gazeuse de Jean UMBER, professeur au lycee Louis Vincent. . Chromatographie: aspects généraux: 1. 1. Définitions: La chromatographie est une méthode physique de séparation basée sur les différences d’affinités des substances à analyser ? performance ou HPLC) ou étalés en couche mince sur une plaque de verre, d’aluminium ou sur une feuille de matière plastique (chromatographie sur couche mince ou CCM) La phase fixe peut aussi être constituée par un liquide imprégnant un support solide ou encore par une chaine carbonée fixée sur un support (phase greffée). insi en chromatographie sur papier, la phase fixe est formée par l’eau que les molécules de cellulose du papier adsorbent, alors qu’en chromatographie n phase gazeuse, elle est constituée d’un liquide peu volatil et thermiquement stable imprégnant un granulé poreux. Phase mobile: La phase mobile est: soit un gaz (ex: chromatographie

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en phase gazeuse): la phase mobile est appelée gaz vecteur ou gaz porteur. ### soit un liquide (ex: chromatographie sur papier, couche mince ou colonne): la phase mobile est appelée éluant.

Nature des phénomènes: On distingue quatre types de phénomènes que nous allons étudier successivement. chromatographie d’adsorption chromatographie de partage ### chromatographie ionique ### chromatographie d’exclusion 1. 2. Chromatographie d’adsorption: Elle est illustrée par la séparation chromatographique classique, sur colonne remplie ou sur couche mince, des composés moléculaires. Phénomènes d’adsorption et de partage. ) l’adsorption est un phénomène d’interface à la différence de l’absorption (reproduit avec l’autorisation de M. Laguës, L’ACtuaIité Chimique 1990, 2 0 hydrophile, s’orientent à l’interface comme en témoigne l’exemple de l’orangé d’acridine en phase aqueuse. (Chem. & Eng. News 1991, 69(37) p. 25). Polarité des phases: Les séparations sont basées sur le principe de polarité c’est à dire ‘existence de dipôles. Le pouvoir éluant d’un liquide dépend de sa propre polarité.

Les liquides classés ci-dessous le sont par polarité croissante. On obtient ainsi une série éluotropique. éther de pétrole cyclohexane tétrachlorométhane trichloréthène toluène benzène dichlorométhane éther diéthylique trichlorométhane éthanoate d’éthyle pyridine propanone propan-l -01 éthanol méthanol eau acide éthanoïque Adsorbants: Les adsorbants figurant dans la liste ci-dessous sont classés selon l’ordre croissant de leurs forces d’interactions avec des composés polaires. papier, cellulose

Kieselguhr, terre de diatomées Amidon Sucres 3 0 Lorsque les solutés sont neutres, l’ordre d’adsorption sur un adsorbant polaire comme le gel de silice ou l’alumine est le même que celui présenté pour les solvants. Les solutés apolaires (ex: alcanes) sont peu adsorbés alors que les solutés polaires (ex: méthanol) le sont fortement. par contre, on utilisera de préférence l’alumine pour séparer des solutés basiques comme les amines et le gel de silice pour les phénols et les acides car les solutés acides sont fortement adsorbés par l’alumine alors que les solutés basiques le sont par la silice. 3. Chromatographie de partage: Elle est fondée sur la différence de solubilté des substances ? séparer dans deux fluides parfaitement miscibles. Elle est mise en pratique en chromatographie sur papier. un des fluides est un liquide retenu sur un support inerte et constitue la phase stationnaire. L’autre, liquide ou gaz en déplacement, constitue la phase mobile. Le facteur principal qui inten,’ient est le coefficient de partage entre chaque phase.

On peut séparer des solutés dont les coefficients de partage entre les deux phases sont différents. es plus solubles dans la phase mobile se déplacent plus acilement que ceux qui le sont moins. un autre facteur qui intervient est la polarité de la phase: ainsi en HPLC on peut utiliser des phases stationnaires peu ou non polaires, la phase mobile étant polaire (eau ou mélange eau – méthanol): on parlera alors de chromatographie de partage ? polarité de phase inversée. 1. 4.

Chromatographie ionique: La phase mobile est une solution tampon aqueuse et la phase stationnaire la plus courante est constituée de polystyrène sous forme de sphères de quelques micromètres de diamètre, lesquelles ont été chim 4 0 polystyrène sous forme de sphères de quelques micromètres e diamètre, lesquelles ont été chimiquement transformées en surface pour faire apparaître des sites ioniques. Ces phases permettent l’échange de leurs contre-ions mobiles avec des ions, de même signe, présents dans la phase mobile.

La séparation repose sur les coefficients de distribution ionique entre les deux phases. 1. 5. Chromatographie d’exclusion: La phase stationnaire est généralement un polymère poreux dont les pores ont des dimensions choisies en rapport avec la taille des espèces à séparer. On réalise une sorte de tamis à l’échelle moléculaire, dit à perméation sélective. Le coefficient de partition s’appelle dans ce cas le coefficient de diffusion. Cette technique est encore appelée filtration sur gel ou perméation de gel selon la nature de la phase mobile (aqueuse ou organique). diamètre des pores est une caractéristique de chaque type de un mélange de solutés de masses molaires variables traverse une épaisseur donnée de gel: les grosses molécules, celles dont le diamètre est supérieur à celui des pores, sont exclues et éluées les premières; les petites et moyennes molécules sont éluées plus tardivement, car incluses, leur migration est freinée en iffusant dans le gel. La séparation est donc réalisée par le fait que les solutés sont élués dans l’ordre inverse des masses molaires. 2 Chromatographie sur couche mince (CCM) 2. 1 .

Définition et appareillage: La chromatographie sur couche mince (CCM) repose principalement sur des phénomènes d’adsorption : la phase mobile est un solvant ou un mélange de solvants, qui progresse le long d’une phase stationnaire fixée sur une plaque de verre ou sur une feuille s 0 qui progresse le long d’une phase stationnaire fixée sur une plaque de verre ou sur une feuille semi-rigide de matière plastique ou d’aluminium. Après que l’échantillon ait été déposé sur la phase stationnaire, les substances migrent à une vitesse qui dépend de leur nature et de celle du solvant.

Les principaux éléments d’une séparation chromatographique sur couche mince sont. la cuve chromatographique : un récipient habituellement en verre, de forme variable, fermé par un couvercle étanche. ### la phase stationnaire : une couche d’environ 0,25 mm de gel de silice ou d’un autre adsobant est fixée sur une plaque de verre à l’aide d’un liant comme le sulfate de calcium hydraté (plâtre de Paris) l’amidon ou un polymère organique. ## l’échantillon : environ un microlitre WI) de solution diluée ( 2 à 5 %) du mélange à analyser, déposé en un point repère situé au- dessus de la surface de l’éluant. ## l’éluant : un solvant pur ou un mélange : il migre lentement le long de la plaque en entraînant les composants de l’échantillon. 2. 2. Principe de la technique. Lorsque la plaque sur laquelle on a déposé l’échantillon est placée dans la cuve, l’éluant monte à travers la phase stationnaire, essentiellement par capillarité. En outre, chaque composant de l’échantillon se déplace à sa propre vitesse derrière le front du solvant. Cette vitesse dépend d’une part, des forces électrostatiques retenant le composant sur la plaque stationnaire et, d’autre part, de sa solubilité dans la phase mobile.

Les composés se déplacent donc alternativement de la phase stationnaire à la phase mobile, l’action de rétention de la phase stationnaire étant principalement contrôlée par des phénomènes dadsorpti 6 0 de rétention de la phase stationnaire étant principalement contrôlée par des phénomènes d’adsorption. Généralement, en chromatographie sur couche mince, les substances de faible polarité migrent plus rapidement que les composants polaires. 2. 3. Applications de la CCM. Corque les conditions opératoires sont connues, elle permet un contrôle aisé et rapide de la pureté d’un composé organique.

Si l’analyse, réalisée avec divers solvants et différents adsorbants, révèle la présence d’une seule substance, on peut alors considérer que cet échantillon est probablement pur. De plus, étant donné que la chromatographie sur couche mince indique le nombre de composants d’un mélange, on peut l’employer pour suivre la progression d’une réaction. La chromatographie sur couche mince est également la technique habituellement employée pour rechercher le meilleur solvant, vant d’entreprendre une séparation par chromatographie sur colonne. 2. 4. Adsorbants et plaques chromatographiques.

Par ordre d’importance décroissante, les adsorbants employés en CCM sont : le gel de silice, l’alumine, le kieselguhr et la cellulose. Les plaques vous seront fournies prêtes à l’emploi. 2. 5. Choix de l’éluant. L’éluant est formé d’un solvant unique ou d’un mélange de solvants. Un éluant qui entraine tous les composants de l’échantillon est trop polaire,’ celui qui empêche leur migration ne l’est pas suffisamment. Une méthode simple pour trouver l’éluant approprié consiste ? réparer des solutions de l’échantillon dans différents solvants, en concentration d’environ 2 à en volume.

A l’aide d’une micropipette, on dépose une goutte de chaque solution sur une plaque, chacune séparée d’environ 1 cm. Le meilleur éluant 0 une goutte de chaque solution sur une plaque, chacune séparée d’environ 1 cm. Le meilleur éluant est celui qui, lorsqu’il a terminé sa migration, a entraîné le soluté à une distance d’environ la moitié de celle qu’il a parcourue. une autre méthode consiste à déposer une solution des substances à analyser en plusieurs points, séparés d’environ 2 cm.

Après séchage, on applique au centre de chaque point une micropipette remplie de solvant; Après diffusion, l’éluant qui convient sépare les solutés. Choix de l’éluant dans le cas d’analyses ### dhydrocarbures : hexane, éther de pétrole ou benzène. de groupements fonctionnels courants : hexane ou éther de pétrole mélangés en proportions variables avec du benzène ou de l’éther diéthylique forment un éluant de polarité moyenne. ### de composés polaires : éthanoate d’éthyle, propanone ou méthanol. 2. 6. Dépôt de l’échantillon.

L’échantillon est mis en solution (2 à 5 %) dans un solvant volatil, ui n’est pas forcément le même que l’éluant : on emploie fréquemment le trichlorométhane (chloroforme),la propanone ou le dichlorométhane. l_a solution est déposée en un point de la plaque situé à environ 1 cm de la partie inférieure. Il est important que le diamètre de la tache produite au moment du dépôt soit faible; idéalement, il ne devrait pas dépasser 3 mm Ce sont généralement les dépôts les moins étalés qui permettent les meilleures séparations.

Pour augmenter la quantité déposée, il est toujours préférable d’effectuer plusieurs dépôts au même oint, en séchant rapidement entre chaque application plutôt que de déposer en une seule fois un rand volume d’échantillon qui produirait une tache plus I 8 OF bo fois un grand volume d’échantillon qui produirait une tache plus large. ‘échantillon est déposé à l’aide d’une micropipette ou d’un tube capillaire en appuyant légèrement et brièvement l’extrémité de la pipette sur la couche d’adsorbant en prenant soin de ne pas le détériorer. On peut aussi utiliser l’extrêmité, un peu émoussée, d’un cure-dent.

On vérifie l’identité des composants présumés d’un échantillon, n procédant à un dépôt séparé d’une solution de chacun d’eux puis à celui de leur mélange. Ces solutions témoins permettent de comparer la migration de chaque composé avec celle de l’échantillon à analyser. 2. 7. Développement de la plaque. e développement consiste à faire migrer le solvant sur la plaque. Dans les analyses usuelles de laboratoire, le principal type de développement est la chromatographie ascendante : la plaque est placée en position verticale dans une cuve et le solvant qui en recouvre le fond monte par capillarité.

Le niveau de liquide est ajusté à environ cm du fond de la uve; on place souvent du papier filtre contre les parois de la cuve pour saturer plus rapidement la cuve en vapeurs d’éluant et éviter les effets de bords. Pendant le développement du chromatogramme, la cuve doit demeurer fermée et ne pas être déplacée. Lorsque la position du front du solvant arrive à environ 1 cm de l’extrémité supérieure, la plaque est retirée de la cuve, le niveau atteint par le solvant est marqué par un trait fin, puis la plaque est séchée à l’air libre ou à l’aide d’un séchoir. 2. 8. Révélation.

L’identification des substances isolées se fait selon différentes éthodes (valable également our la chromatographie sur papier): 60 méthodes (valable également pour la chromatographie sur ### directement si les substances sont colorées ### à l’aide de révélateurs si elles sont incolores afin de les transformer en taches colorées; les produits sont souvent décelés par leurs réactions fonctionnelles classiques les acides aminés par la ninhydrine qui donne avec la plupart une couleur bleu- violet, les acides organiques par des indicateurs colorés, les sucres par le réactifde Molisch qui utilise le pouvoir réducteur des sucres.

Quelques réactifs comme l’iode ou le permanganate donnent des colorations non spécifiques avec la plupart des composés organiques. toutes les ubstances ayant une absorption dans la région au- dessus de 230 nm sont étudiées sur des supports additionnnés de corps fluorescents par irradiation de lumière UV à ondes courtes (Ornax< 254 nm).

L’emploi de couches non additionnées de produits fluorescents permet aussi la mise en évidence de beaucoup de substances dans l’UV à ondes courtes (Dmax 366 nm) par suite de la fluorescence propre des composés. Dans tous les cas, il faut noter les positions des taches colorées uste à la fin de la chromatographie en les cerclant car certains produits disparaissent avec le temps. 2. 9.

Calcul de Rf (retarding factor ou rapport frontal) dl : distance parcourue par le composé (mesure au centre de la tache) ds : distance parcourue par le front du solvant Pour un couple éluant et support déterminé, Rf est une caractéristique de chaque soluté à la température de l’expérience. Rf est toujours indépendant dfe la longueur de bande utilisée. 2. 10. Description d’une analyse par CCM selon l’ordre chronologique. Préparation de la cuve chromatographique. 0 0