Sous clonage du promoteur de Gabarapl

Sous clonage du promoteur de Gabarapl

De nombreux tests ont été réalisées pendant les manipulations pour infirmer la présence de l’inséré ou du vecteur à ces moments précis, notamment des électrophones. Nous allons donc détailler dans ce paragraphe les étapes précises de l’expérience. PIC (polymériser chant réaction) Pour réaliser l’amplification, le milieu réactionnaire doit contenir pli de plaide objet contenant l’inséré, 0,4 PLU démorde sens de Sac I (gicle caissons), HL d’amorce reverse hindi il (gicle caissière).

Un tampon d’amplification contenant du chlorure de magnésium est indispensable à la réaction c’est pourquoi pal_ doivent être ajoutés tout comme MM de énucléations. La cuve est ainsi complétée avec de l’eau (plu_) pour obtenir un volume final de plu Enfin 0,04 unité de tac polymériser doivent être introduits au dernier moment. Un deuxième tube doit également être réalisé afin de réaliser un test contrôle pour la suite. Ainsi celui-ci doit contenir les divers éléments cités ci-dessus mais sans matrice d’DAN. Par conséquent un volume d’eau doit être ajouté en plus pour combler le manque soit lui. Ar ces procédés, la PIC est prête et sur une durée totale de ah. Contrôle de la PIC par électrophones Dans un premier temps, il est nécessaire de préparer le support e

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l’électrophones, pour cela, legs de saccharine doivent être mis à ébullition avec mal de tan on ÉTÉ 0,EX. Après refroidissement, ce mêlant ait dans le moule de EU refroidissement, ce mélange a été introduit dans le moule de l’électrophones sur une épaisseur d’environ 0,cm et sans oublier de placer les bandelettes qui laisseront place une fois sec aux puits.

Pendant ce temps, les deux tubes de la PIC sont préparés c’est à dire que nous avons introduit dans chacun 1 de tampon de charge DAN EX qui contient 0,plu de saccharine et 0,pull de bleu de promènent). Ainsi les deux solutions ont été introduites dans deux puits distincts puis l’électrophones a été mise en fonctionnement sur AV pendant environ 30 minutes. Les résultats sont exposés et commentés par la suite. D’gestion du plaide objet contenant l’inséré : gabarrier Nous avons ajouté dans un tube pendrons de contenance 1,ml pomme d’acheté de sodium puis pull d’tenante absolu.

Après avoir bien mélangé le mélange, la solution a été placée 10 minutes dans la glace puis placée 10 minutes à la centrifugeuse 10 âge, CC. Ensuite, lia fallu éliminer le surnageant. Par la suite, pal_ d’tenante à ont été ajoutés puis une nouvelle confrontation à 10 000 g pendant 5 minutes a été réalisée. Nous avons ensuite pu digérer le plaide par deux enzymes de restriction. Pour cela, le culot issu de l’expérience précédente a été dilué dans plu d’eau lutta pure, puis pal_ de tampon de restriction 1 EX Tango ont été ajouté afin d’obtenir un rapport de EX final.

Enfin le professeur a introduit 1 PLU de chaque enzyme de restriction, à savoir sacs et hindi. L’incubation à CC s’est ensuite déroulée sur une durée de ah. Ouverture du plaide page De la même façon que précédées Ur une durée de ah. De la même façon que précédemment, pal du plaide page ont été introduit dans une solution contenant plu d’eau lutta pure et pal de tampon de restriction Tango à SOI. Le professeur a également ajouté 1 AL des deux enzymes de restriction précédentes. De même, l’incubation à 37 oc a durée ah.

Au terme de ces deux incubations, nous avons procédé à une électrophones avec les deux produits obtenus. Pour cela un gel dégagerons a fallu être préparé de la même manière que détaillé précédemment puis coulé dans une cuve à électrophones. 2 VOL es deux solutions incisées ont été introduites séparément dans deux tubes pendrons contenant 81_11_ d’eau et pal de tampon de charge CA Enfin ces deux solutions ont été entièrement déposées dans des puits différents avec en plus 1 pal_ d’un marqueur de l’électrophones a été mise en taille d’DAN « 1 cube plus leader fonctionnement pendant une durée de 35-40 minutes.

Puis le gel a été placé 10 minutes dans une solution de tampon TE avec du bordure d’étudié pour ensuite être rincé à l’eau pendant 5 minutes. Le gel a enfin pu être analysé sous VU. Les résultats de été expérience sont présents dans la suite de cet article. Purification de l’inséré et du plaide sur gel d’égarés La méthode de purification consistait à faire migrer les solutions d’inséré et de plaide sur un gel d’électrophones puis de récupérer les bandes correspondantes à ces deux fragments.

Pour cela, le restant des deux préparations d’inséré et de plaide incuber c’est à dire gel ont été ajouté de BAL de tampon de charge 4 EU préparations d’inséré et de plaide incuber c’est à dire plu ont été ajouté de pal de tampon de charge EX. Un nouveau gel ‘électrophones a dû être préparé et coulé puis la totalité des deux solutions a été introduite dans deux puits distincts. Une fois la migration réalisée, le gel a été placé dans une solution de tampon TE contenant du bordure d’étudié pendant 10 minutes puis rincé à l’eau durant 5 minutes.

Ensuite la découpe des bandes d’DAN du gel de l’électrophones a été réalisée grâce au transatlantique VU. Pour réaliser cette manipulation, nous devions impérativement être munies d’un masque pour protéger notre tête des rayons. Ainsi grâce à un scalpel, nous avons découper le plus justement possible les deux bandes représentant l’DAN afin de les placer distinctement dans des tubes pendrons propres de pull_ dont le fond était percé mais bouché par un peu de laine de verre.

Ensuite nous avons utilisé la méthode du freezer queues afin de séparer l’égarés issu du gel d’électrophones de l’DAN. Pour cela, les tubes pendrons d’inséré et de plaide ont été placés dans l’azote liquide afin de les congeler. Ils ont été ensuite introduit dans un plus gros tube pendrons de 1,ml afin de d’effectuer la confrontation de 15 minutes, 5 000 g et à température ambiante. La phase aqueuse a ensuite été prélevée et placée dans de la glace alors que le restant de la solution a de nouveau subit la même confrontation deux fois après prélèvement à chaque fois de la phase aqueuse.

Ensuite, une autre purification a été réalisée afin d’obtenir les meilleurs résultats possibles, pour cela les s E purification a été réalisée afin d’obtenir les meilleurs résultats possibles, pour cela les deux solutions obtenues ont été ajouté plu_ de phénol/chloroforme/alcool symbolique (25/24/1). Cette manipulation a dû être réalisée sous la hotte et avec des gants. Les nouvelles préparations ont ensuite été mélangées au avorte pendant 10 secondes avant de subir une confrontation de 10 minutes à 10 000 g à CC.

La phase aqueuse supérieure a ensuite été prélevée et nous y avons ajouté lui d’une solution de chloroforme/alcool symbolique avant de centrifuger l’ensemble pendant 5 minutes à 10 âge à CC. La phase aqueuse supérieure a enfin été séparée et placée dans la glace. Les solutions ont enfin subit une dernière purification à l’alcool éthylique, en présence d’acheté de sodium. Pour cela, plu_ d’acheté de sodium et pull_ d’tenante absolu ont été ajouté au bue pendrons contenant l’inséré tandis que plu d’acheté de sodium et pull d’tenante absolu ont été Introduit à la solution contenant le plaide.

L’ensemble des préparation a été mélangé au avorte puis placé 10 minutes à -CC. Ensuite ils ont subi une confrontation durant 15 minutes, à 10 âge à CC. La phase aqueuse a été éliminée et le culot rincé avec 1 goal d’tenante puis placé à centrifuger pendant 5 minutes à AI âge à CC. La phase liquide a été de nouveau éliminée et le culot laissé ouvert afin de le sécher. Une fois secs, ils ont été repris dans plu d’eau stérile.

Ligature des deux fragments Le principe au niveau de cette étape était de faire la légation du plaide et de l’inséré. L’inséré et le plasma 6 E cette étape était de faire la légation du plaide et de l’inséré. L’inséré et le plaide ont été mélangés avec l’enzyme légalise qui a créé la liaison phosphorescentes entre les extrémités 5′ phosphate et 3′ OH des deux fragments. Le plaide peausseries ainsi refermé devenait récriminant. Pour réaliser cette ligature nous avons d’abord vérifié la présence de l’inséré et du plaide sur un gel d’égarés.

Pour cela nous avons déposé dans un puits un mélange de Ul de plaide avec épi d’eau et pal de tampon DAN EX et dans un autre puits le même mélange avec 2 plu d’inséré à la place du plaide. Nous avons fait migrer cote à cote le plaide et pinter afin d’évaluer les concentrations de plaide et d’inséré. Après la vérification nous avons fait un mélange entre le plaide et l’inséré de sorte que le rapport des volumes soit égal à 3. Nous avons mis dans un tube pendrons de 1,ml un volume de AH d’inséré, nous avons ajouté Ul de plaide puis 1 Ul de tampon de ligature SOI.

Le professeur a ensuite ajouté pli d’enzyme légalise. Le mélange a été incuber sur toute la nuit à CC. Transformation bactérienne Le deuxième jour on a procédé à la transformation bactérienne. Mais avant de transformer, on a d’abord réalisé la préparation de souches de. Colis compétentes avec la méthode de chlorure de calcium. Pour cela, une solution de pré-culture a été faite la veille. Le professeur a prélevé dans le milieu de culture LIB ou milieu luira-bernant qui est un milieu standard pour la culture de. Loi, ml qu’elle a ensemencé avec une colonie de bactéries JAMBE prélevée sur une boite de LIB-agir. L qu’elle a ensemencé avec une colonie de bactéries JAMBE prélevée sur une boite de LIB-agir. La pré-culture a été réalisée sur la nuit en incubation 37 oc sous agitation. Donc le jour 2 nous avons commencé les manipulations en prélevant pull de la pré-culture que nous avons mis dans un tube pendrons de 1,ml. A ces pull on a ajouté ml de milieu LIB. Ce même mélange est réalisé dans un autre tube pendrons qui va servir à mesurer l’absorbante toute les minutes.

Ces manipulations ont été réalisées sous hotte pour éviter d’éventuelles contamination. Les mélanges dans les deux tubes sont mis dans un bain marie et on a vérifié la pousse des bactéries toutes les émeutes Ar expérimenterions en mesurant l’absorbante à 600 mm. L’absorbante cible était de 0,7. Donc sur une durée d’environ ah de temps nous avons atteint 0,61 5 d’absorbante ce qui était suffisant pour notre manipulation. La valeur cible atteint nous avons placé le tube d’pendrons stérile dans la glace pendant minutes.

Puis les minutes écoulées, nous avons transvasé la pré-culture dans 2 tubes d’pendrons de 1,ml. Les volumes transvasés n’étant pas très différents il n’ pas été nécessaire pour nous d’utiliser d’autres tubes pendrons avec de l’eau pour équilibrer au niveau de la centrifugeuse. Nous avons donc directement centrifuge nos deux tubes à 5000 g pendant AI minutes à CC. Après la confrontation, nous avons enlevé sous la hotte la totalité du surnageant. Nous avons ensuite remis en suspension chaque culot de nos 2 tubes dans 1,5 ml de cacao à concentration M.

La suspension a été laissée 30 minutes dans la gel tubes dans 1,5 ml de cacao à concentration 0,1 M. La suspension a été laissée 30 minutes dans la glace. Puis le mélange a été centrifuge à 5000 g pendant 10 minutes à CC. Nous avons ensuite enlevé le surnageant et remis les bactéries comme auparavant en suspension dans pull de cacao 0,1 M. Les contenus des deux tubes ont été pôles. La préparation de. Colis compétente finie nous sommes passées la transformation des bactéries. Euro cela nous avons mélangé dans un tube pendrons stérile de 1,ml les pull de bactéries compétentes avec la totalité du mélange de la légation préparé le er jour et nous avons incuber le tube pendant minutes dans la glace. Puis le tube a été placé dans le bain marie à CC pendant exactement 90 secondes sans le secouer et nous l’avons rapidement transférer dans la glace pour une durée de minutes. Pie du milieu LIB ont été ajoutés avant d’incuber le tube ah à CC dans un agitateur rotatif qui permettait à la solution de bien se mélanger et de ne pas avoir de dépôt au fond du tube.

Une fois les minutes écoulées nous avons pris deux boites de LIB-agir-implication. Sur l’une nous avons étalé sous hotte pie de la suspension bactérienne. La boite est placée au niveau de la cuve. Ensuite nous avons repris notre suspension puis nous l’avons encore centrifuge à 300 g pendant 2 minutes. Le surnageant a été presque entièrement éliminé jusqu’ laisser un tout petit volume dans lequel nous avons remis en suspension le culot bactérien en le pipetas. La suspension a été finalement étalée sur la deuxième boite de LIB- agir-amplifient.

Les deux boites ont été incisées finalement étalée sur la deuxième boite de LIB-agir-implication. Les deux boites ont été incisées une nuit à 37 oc pour permettre aux bactéries de former des colonies sur la glose. Analyse des clones de bactérie recommençant Nous avons fait l’analyse des clones de bactéries reconnaissantes ensemencées lors de l’étape précédente. Cette analyse s’est effectuée sur deux étapes. Extraction plastique par min-pré Pour la réalisation de des étapes de la miniaturisation, une suspension a été préparée la veille.

En effet, sur les boites que nous avons ensemencé la veille, le professeur a prélevé des bactéries de 2 colonies ayant poussées à l’aide d’un cure dent stérile. Elle a ensuite plongé chaque cure dent dans un tube contenant ml de LIB additionné d’amplifient en visant une concentration de page/ml. Ensuite elle a laissé pousser les bactéries toute la nuit. Mais nos bactéries n’ayant pas poussées sur les boites de LIB-agir-amplifient elle a utilisé les bactéries de a préparation pour préparer nos suspensions.