Etude clinique de l’effet des carraghénanes sur l’organisme des chats

Etude clinique de l’effet des carraghénanes sur l’organisme des chats

Présentation Les polysaccharides sulfatés ont été très largement étudiés ces dernières années principalement pour leurs propriétés antivirales contre de nombreux virus enveloppés tels que le virus de l’herpès (HSV), le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) le cytomégalovirus (CMV). Ces composés sont extraits de la phase amorphe de la paroi des algues rouges. De nombreuses études in vitro ont démontrés que ces polysaccharides ont la capacité d’inhiber la réplication du virus en bloquant son attache Carraghénanes Les carraghénanesp HSV-2.

Le blocage de émontré lors d’une org to nextÇEge et contre HSV-I et par ceux-ci a été ient ainsi capables de de fixer à l’épitope hypervariable V3 de la protéine gp 120 (une protéine d’attachement présente dans l’enveloppe de nombreux virus) or cet épitope V3, nécessaire lors de l’attachement du virus à la surface de la cellule, se fixe au récepteur associé au récepteur CD4 des lymphocytes T4 (cellule cible du VIH), sans cette fixation de la boucle VB au récepteur associé, la protéine est incapable de se fixer correctement ainsi le virus ne pourra en aucun cas énétrer dans le cellule (Figure).

Figure : Fixation du VIH sur un lymphocyte T4 appartient au groupe des Alphaherpesvirinae. C’est un virus ? ADN enveloppé qui possède

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une structure et une pathogénicité très similaire à I’HSV. Ce virus cause un fort taux de mortalité chez les chats dû à ces effets sur le système respiratoire et sur les yeux. Il est responsable d’une conjonctivite chez le chat. [Ces études seront mises en avant dans cette partie du projet tuteuré et intégreront le processus d’autorisation de mise sur le marché d’un médicament].

Etude in vitro Des cellules rénales de chats ont été cultivées dans un milieu spécifique le DMEM en présence d’antibiotique tels que : gentamicine, streptomycine. Une souche virulente de FHV-I a été utilisée pour toutes les cultures virales, cette souche fut mise en contact avec les cellules citées précédemment. Les carraghénanes utilisés ont été mis en solution dans du DMEM pour tous les dosages.

Différentes expérience ont été réalisées dans cette étude in vitro Un dosage en plaque Une titration des virus Une PCR quantitative Un dosage de la cytotoxicité n dosage de l’activité anticoagulante Dosage en plaque Méthode : Des cellules ont été mise en culture dans des plaques à six puits. Puis lorsque les cellules sont arrivées à une forte concentration dans le milieu, celui-ci a été remplacé par des concentrations croissantes en carrghénanes. Le virus fut ajouté soit avant les carrghénanes ou par la suite dans les différents puits.

Les cultures ont été incubées pendant 3 jours à 37 oc, puls ont été colorées au cristal violet. La concentration inhibitrice 50 (CISC)) et la concentration inhibitrice 90 (C190) ont été déterminées. oncentration inhibitrice 50 (C150) et la concentration inhibitrice 90 (C190) ont été déterminées. Résultats : Lorsque les carraghénanes furent ajoutés avant le virus la concentration inhibitrice 50 était de 5vg/ml et la concentration inhibitrice 90 de 25pg/ml.

Cependant lorsque les carraghénanes ont été ajouté à la suite du virus, aucune concentration en carraghénanes n’a été effective pour réduire la formation de plaques virales. Titration des virus Méthode : Une suspension virale à 107/ml a été utilisée, huit dilutions au 1/10 ont été par la suite réalisées. Trois oncentrations différentes en carraghénanes ont été ajoutées avant et après radsorption des vlrus aux cellules afin de déterminer leurs effets sur les différents titres de virus. Les échantillons ont été incubés 3 jours à 37 oc.

Résultats : Il ny a pas eu de différence significative entre les échantillons lorsque que les carraghénanes ont été ajoutés avant ou après l’adsorption. De plus les trois concentrations en carraghénanes ont eu les mêmes effets sur le titre des échantillons viraux. PCR quantitative Méthode : Une PCR quantitative a été réalisée à partir des ?chantillons utilisés pour la titration virale décrite précédemment. L’ADN a été extrait de chacun d’entre eux en utilisant un kit d’extraction commercial.

Le nombre de copie de virus a été déterminé pour chaque échantillon. Résultats : Une diminution non significative du nombre de virus a pu être observée lorsque les carraghénanes ont été ajoutés avant ou après. Par exemple pour un titre de départ de 2,6. 109/ml et une concentration de carraghénanes de 250pg/ml Par exemple pour un titre de départ de 2,6. 109/ml et une concentration de carraghénanes de 250vg/ml : Carraghénanes ajoutés avant l’adsorption : Le titre était de 7,2. 106/rnI Carraghénanes ajoutés après l’adsorption : Le titre était de 1,9. 08/mI Dosage de la cytotoxicité Méthode : La cytotoxicité fut déterminée en observant l’effet de carraghénanes à des concentrations de 250 et 500gg/mI sur des cellules vivantes. La concentration cytotoxique 50 (CC50) sera définie en calculant le nombre de cellules mortes après 24 et 48h d’incubation. Résultats : Les deux concentrations de carraghénanes n’ont pas affecté la viabilité des cellules. Dosage de l’activité anticoagulante Méthode : Le temps de céphaline a été mesuré en utilisant du un pool de plasma frais de chats cliniquement sains.

Différents échantillon contenant 50gL de carraghénane a différentes concentrations. Le témoin négatif fut réalisé à partir de plasma hépariné (action anticoagulante) tandis que du plasma citraté fut utilisé en tant que témoin positif. Résultats : Le temps de céphaline pour le témoin positif était de 14 secondes, alors que le témoin négatif était de 125 secondes. Lorsque le carraghénane fut ajouté dans le plasma, le temps de éphaline augmente dès que la concentration augmente (Figure). Figure • Effets de la concentration en carraghénane sur le temps de céphaline (PTT) PAGF stérilisés.

Les chats étaient négatifs pour la présence du virus de la leucémie féline et de l’immunodéficience féline. Bien que les chats soient exempts de tout virus des voies respiratoires, ils ont tous été vacciné avant cette étude contre l’herpes virus félin, calicivirus, leukopenia virus et Chalmydophila felis. La moitié des chats ont été vaccinés 12 mois avant l’étude, et l’autre moitié a été vaccinée six mois avant l’étude. Chaque chat a reçu deux vaccinations sous-cutanées à des intervalles de 2 semaines. Bien que la vaccination puisse réduire la gravité du virus FVH-I, la conjonctivite reste très marquée.

Phase 1 : Irritations oculaires Méthode : Cette étude a pour but de démontrer une quelconque irritation oculaire, sur trois groupes de chats, après des injections de carraghénanes à différentes concentrations. Chaque chat a reçu pendant une semaine une goutte de solution contenant des carraghénanes à une concentration donné. Au terme de cette semaine les chats ont été examiné afin de détecter la présence e maladie oculaire telle que : le blépharospasme, Ihyperémie conjonctivale ainsi qu’une ulcération de la cornée.

Des scores ont été attribués en fonction de l’atteinte ophtalmique selon cette échelle . O négatif ou normal : léger 2 : modéré 3 • sévère Résultats : Aucuns chats des groupes a développé un blépharospasme ou une ulcération de la cornée. Cependant quelque soit la concentration en carraghénane certains chats ont développé une hyperémie conjonctivale légère à modérée. Phase 2 : Induction de la conjonctivite par FVH-I Méthode : L’étude a été réalisée af