Compte Rendu Du TP Lysozyme

Compte Rendu Du TP Lysozyme

Compte rendu du TP : électrophorèse de protéines, électrotransfert et immunorévélation But • L’objectif principal de ce TP est l’analyse par électrophorèse des protéines récupérées dans differentes fractions lors du TP consistant à extraire une molécule d’intérêt, le lysozyme, du reste des protéines dun blanc cyœuf. Principes : – Électrophorèse : il s’agit d’une méthode qui permet de séparer et de caractériser des molécules.

Elle se base sur le déplacement de molécules chargées sous l’effet d’un champ électrique. Du fait de leurs caractéristiq ‘électrophorèse ces or 7 différentes, elles von to View charges identiques, I Nous utiliserons une on des conditions de esses de migration s des autres. A nt selon leur taille. gel, ce gel agit en réalité comme un tamis mol culaire a travers duquel les petites molécules circuleront plus facilement que les grosses et donc migreront plus loin à travers le gel.

Nous avons utilisé un gel de polyacrylamide a différentes concentrations, ces différentes concentrations forment des maillages plus ou moins serrés donc facilitant plus ou moins la migration des différentes molécules. Notre électrophorèse a également été réalisée en conditions dénaturantes en présence de SDS (détergent) qui charge négativ Swipe to View next page négativement l’ensemble des molécules des fractions.

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Ainsi, notre électrophorèse sépare bien nos molécules en fonctions de leurs poids moléculaires, les plus petites migrant plus loin. Gel de séparation et gel de concentration : le gel de séparation constitué d’acrylamide, de bisacrylamide (agent pontant), de TEMED et d’ammonium persulfate (agents permettant la polymérisation) est le premier gel coulé et est le gel de ‘électrophorèse a proprement parlé puisqu’il est le siège de la séparation des molécules. Le gel de concentration est lui coulé au dessus du gel de séparation et a pour but de permettre une entrée homogène de l’échantillon dans le gel de séparation et de le concentrer pour donner une bande fine. Transfert : l’immunorévélation que nous effectuons nécessite un transfert des protéines du gel d’électrophorèse sur une membrane de nitrocellulose. Ce transfert s’effectue selon un montage appelé sandwich dans lequel la nitrocellulose et le gel ont mis en contact entre 2 éponges imbibées de tampon et du papier Watmann. Cet ensemble est alors placé dans la cuve sous un courant électrique de SOV permettant ce transfert. Immunorévélation : après avoir effectué le transfert, nous effectuons une immunorévélation.

Cela consiste en l’utilisation d’anticorps dirgés contre la protéine d’intérêt qui vont donc se fixer à celles-ci. Ce sont ces anticorps que nous pourrons détecter. Cependant, les anticorps ne vont pas se fixer PAG » rif 7 ces anticorps que nous pourrons détecter. Cependant, les anticorps ne vont pas se fixer uniquement sur les protéines et vont avoir tendance a se fixer sur le support rendant illisibles l’immunorévélation. C’est pourquoi on utilise du lait pour saturer tous les espaces vides ou les anticorps seraient susceptibles de se fixer. Glycérol: Le glycérol mélangé à l’échantillon permet d’alourdir celui-ci en vue de procéder à une électrophorèse. En effet, lors du dépôt des échantillons dans les puits de la membrane ceux- ci pourront se déposer directement au fond du puits sans se iffuser dans le milieu (tampon de charge). Résultats Analyse du pouvoir résolutif: Ehgliuehg Acrylamide à 15% Acrylamide à 10% Log PM (en Da) Rf (en cm) Phosphorylase B 5,575187845 1. 7 Sérum Albumine 4,826074803 0. 2. 5 Ovalbumine 4,633468456 1. 2 PAGF3C,F7 de 376 kDa à 14. 4 kDa. Nous avons, grâce au graphique tracé au dessus, pu déterminer le pouvoir résolutif de chacun des gels. Le pouvoir résolutif est une fourchette de poids moléculaire où le pouvoir de séparation des molécules par électrophorèse est optimum. Pour cela, il suffit de tracer log puis en tilisant les tangentes de chacune des courbes, on retrouve un intervalle de poids moléculaire, c’est le pourvoir résolutif.

Pour le gel à 15%: -Valeur haute: 4. 72 – Valeur basse: 4. 4 Pour retrouver les valeurs en Da: log(x)=y etx= 10 y on repasse en Dalton en utilisant une puissance de 10, soit: 104. 72- 52480 Da et 104. 4- 25118 Da Pour le gel à 10%: – Valeur haute: 4. 73 – Valeur basse: 4. 65 soit: 104. 73= 53703 Da et 10465= 44668 Da On constate que le gel à possède une fourchette bien plus restreinte dans laquelle il est pleinement efficace et c’est ourquoi certaines de nos molécules n’ont pas été assez retenues.

On préférera utiliser le gel à 15% pour notre analyse afin d’être plus sûrs que le lysozyme ne sortira pas du gel et que nous pourrons avoir des résultats exploitables. On peut d’ailleurs voir tout de suite que le lysozyme n’a pas été suffisamment retenu lors de l’électrophorèse en utilisant le gel d’acrylamide à 10% puisque la tâche correspondant à celui-ci dans les échantillons FI ou E est absente. Analyse qualitative de l’électrophorèse: Cette électrophorèse va nous permettre de déter