CHROMATOGRAPHIE D’EXCLUSION SUR GEL DE SEPHADEX INTRODUCTION : On se propose au cours de ce TP de séparer un mélange de deux macromolécules protéiques de masses moléculaires différentes (SAB et cytochrome c ) par méthode de chromatographie d’exclusion sur gel séphadex (G50) en déterminant les caractéristiques de notre colonne par exclusion grâce au dextran bleu , de vérifier ensuite notre séparation par spectrométrie et de doser par méthode de Lowry et al nos fraction obtenue or 5 Sni* to View PRINCIPE ET BUT La chromatographie d’exclusion mol culaire (aussi appelée tamis oléculaire ou filtration sur gel) permet de séparer les protéines suivant leur rayon de Stockes. En effet, le volume d’élution(Ve) d’une protéine donnée dépend non seulement de sa masse moléculaire mais également de sa forme, de son hydratation préférentielle, de sa densité, voire de son affinité pour le support. Le rayon de Stockes tient compte de tous ces paramètres . Notre gel utilisé pour ce TP est le Sephadex G-50 dont le domaine de fractionnement est 1500-30000 pour les masses moléculaire globulaire , le sephadex étant des chaînes de polysaccharides (dextran) ramifiées dont les pores sont déterminés par le degré e « cross-linkage » c’est à dire la fréquence des
La seconde protéine à séparer est le cytochrome c de masse moléculaire 12400 dalton est compris dans le domaine de fractionnement, il peut pénétrer plus ou moins profondément dans les pores et ce sera donc la seconde fraction éluée Étant donné que les protéines ont un maximum d’absorbance ? 280 nm dû aux aminoacides aromatiques et que le cytochrome c de couleur rouge est visible à 409 nm , on peut déterminer par spectrophotométrie la concentration de chaque fraction de notre mélange inconnu en utilisant le coefficient d’absorbance de olution protéique pure . Gel utilisé : Sephadex G-50, domaine de fractionnement • 1500-30000. Eluant utilisé : tampon phosphate 0. 1 M à pH=7 Séparation par chromatographie d’exclusion sur colonne de gel séphadex G-50 : 2 dépôts : 1er dépôt • ML de déxtran bleu Le bleu Dextran à une masse moléculaire très élevée, il ne peut donc pas rentrer dans les pores du gel, hors du domaine de fractionnement nous permettra de déterminer les caracteristique de notre colonne De plus son volume d’élution représentera le volume mort de la colonne Volume à partir duquel le bleu Dextran apparait : 20 mL Volume au maximum du pic (volume d’élution Ve = volume mort vo) : 22,5 mC Volume d’éluant contenant le Dextran : 45 m 2ème dépôt:O,2 MI de notr otéique et recueillir l’albumine (premier pic), l’autre contenant le cytochrome c (deuxième pic).
Composé SAB Cytochrome c V1 (volume d’apparition en mL) 20,5 23,5 V2 (volume d’éluant contenant le composé en ml_) 7,2 Ve (volume d’élution en mL) 24,1 35,7 Absorbance 280 nm 409 nm Rapport 409/280 SAB de référence (0,3 mg/m ) 0,365 avec h —57 cm et r — . -116/2 60. 2 cm3 0. 58 cm on peut maintenant d’après nos résultats dédulre les coefficient e partage entre la phase mobile et la phase liquide stationnaire et le coefficient de partage entre la phase liquide et la phase gel ( Kav=Ve_V0/Vcol VO) des différents composés utilisés : Composants Bleu Dextran Kav 0049 0,35 0. 058 0. 48 Facteur de Dilution 45 36 Séparation et dosage des protéines qui est une protéine à masse molaire supérieure au domaine de fractionnement. peut être en parti retenu par le gel. Le rapport A409/A280, permet de déterminer la pureté de nos solutions.
On observe une valeur pour le cytochrome C plus élevé qui peut être du a une erreur de manipu ation mais ce rapport ‘est pas assez significatif pour affirmer que la solution est contaminée. On obtient des teneurs en protéine de fractions recueillies de et 77 % cela signifie que la séparation entre les deux protéines n’est pas complète. Cela, peut-être dû à la qualité du gel ou à des erreurs de mesures. Le rendement étant de 61 on peut dire que nous avons une perte de 39 % des protéines que nous avions au départ. Malgré de possibles erreurs de manipulation, on peut penser que le gel utilisé ici n’est pas optimale quant à la séparation de SAB et de Cytochrome c.
Conclusion : lors de la séparation de deux protéines différente dans un élange via une chromatographie d’exclusion sur gel de Sephadex. On obseNe, au vu de notre faible rendement que ce gel ne semble pas être bien adapté pour les protéines que nous avons utilisé (SAB et cytochrome c). Afin d’améliorer la résolution de séparation de différentes protéines par chromatographie d’exclusion sur gel il faudrait adapter le domaine de fractionnement de manière plus précise,un domaine de fractionnement plus faible aurait permis que la protéine SAB soit complètement exclue comme le bleu Dextran et on aurait eu des coefficients de partage nuls.
